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L-乳酸脱氢酶（L-Lactate dehydrogenase,L-LDH,EC 1.1.1.27）是一种重要的生物催化剂,理论上能将底物100%转化为单一构型的产物。L-LDH可不对称还原苯丙酮酸（Phenylpyruvic acid,PPA）生成L-苯乳酸（L-Phenyllactic acid,L-PLA）。光学纯L-PLA是一种高附加值的有机酸和天然防腐剂,在食品、饲料、制药和材料等领域有广阔的应用前景。目前已有多种可催化PPA的L-LDH被发现,但至今仍未有一种L-LDH能够满足工业生产的要求。酶的催化活性低、稳定性差和选择性不高等缺陷极大地限制了其的工业化应用。为获得一种性状优良的L-LDH,本研究将来源于干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CICIM B1192的三种L-LDH基因分别在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中实现表达。比较这三种L-LDH对PPA的活性后,确定了高活性的L-Lc LDH1。在此基础上,基于理性设计提高该酶对PPA的催化活性并进行应用工艺的初步研究,主要研究成果如下:以L.casei总DNA为模板,采用PCR技术扩增出三种L-LDH的编码基因Lcldh1、Lcldh2和Lcldh3。借助表达质粒pET-22b（+）将这三种基因分别在E.coli BL21（DE3）中实现了表达。E.coli/Lcldh1全细胞在相同条件下催化10 mM PPA生成了6.9 mM L-PLA,对映体过量值（eep）>99%,显著高于E.coli/Lcldh2和E.coli/Lcldh3。另外,L-LcLDH1、L-LcLDH2和L-LcLDH3的粗酶液催化PPA的活性分别为21.9 U·mg-1、18.4 U·mg-1和16.9 U·mg-1。以上数据表明了L-LcLDH1对PPA表现出了高的催化活性。利用Ni-NTA亲和层析法纯化了L-LcLDH1,其比活性为75.5 U·mg-1。酶学性质分析表明,L-LcLDH1最适温度和最适pH值分别为40℃和5.0,在40℃以下及pH值4.56.0之间具有较好的稳定性;3 mM Ag+和5 mM Pb2+均对L-LcLDH1的活性具有较强的激活作用;L-Lc LDH1对PPA的Km值为8.23 mM,催化效率(kcat/Km)值为11.5 m M-1·s-1。基于理性设计确定了四个关键氨基酸突变位点,利用全质粒PCR法分别构建了四个重组质粒pET-22b-Lcldh1Q88R、-Lcldh1D183N、-Lcldh1I229A、-Lcldh1T235G,转化E.coli BL21（DE3）。以PPA为底物,L-Lc LDH1Q88R和L-LcLDH1I229A的比活性分别为451.5U·mg-1和512.4 U·mg-1。二者的kcat/Km值分别是L-LcLDH1的4.8和5.2倍。随后,分别以pET-22b-Lcldh1Q88R和pET-22b-Lcldh1I229A为模板,构建了两个定点饱和突变文库E.coli/Lcldh1Q88R/I229X和E.coli/Lcldh1I229A/Q88X。经过两步筛选从这两个突变文库中筛选出最优转化子E.coli/Lcldh1Q88R/I229Q和E.coli/Lcldh1I229A/Q88A。L-LcLDH1Q88R/I229Q和L-LcLDH1I229A/Q88A对PPA表现出了较高的比活性,分别是L-Lc LDH1的19.9和38.8倍。另外,二者的kcat/Km值分别是L-LcLDH1的6.8和35.2倍。突变酶L-LcLDH1I229A/Q88A对PPA表现出了最佳的催化特性。以E.coli/Lcldh1I229A/Q88A全细胞为催化剂,催化90 mM以内的PPA时,不对称还原反应可以在10 h内完成,且最终产物L-PLA（eep>99%）的产率均大于95%。通过分批补加底物,E.coli/Lcldh1I229A/Q88A全细胞催化PPA生成了99.8 mM L-PLA,时空产率为1.4 g·L-1·h-1,是直接催化150 mM PPA生成L-PLA的时空产率(0.4 g·L-1·h-1)的3.5倍。这些研究成果为生物催化制备L-PLA的工业化生产奠定了基础。