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NK/T细胞淋巴瘤（NKTCL）是一种起源于成熟NK/T细胞的淋巴系统恶性肿瘤,属于非霍奇金淋巴瘤（NHL）亚类,其临床表现独特,淋巴瘤细胞常以血管为中心向周围浸润,伴组织破坏和局灶坏死。2001年NKTCL被WHO作为一种独立的临床病理分型正式列入恶性淋巴瘤的新分类。此型淋巴瘤可侵及所有结外器官,常见于鼻及鼻腔、皮肤、胃肠道、上呼吸道等。与多数鼻咽癌相似,NKTCL与EB病毒（EBV）感染高度相关,具有明显的地理分布差异和种族特异性,高发于亚洲,尤其是东南亚和中国南方地区。NKTCL侵袭性强,并易对化疗产生耐药性。目前虽有CHOP、SMILE等化疗方案可供选择,但临床治疗效果欠佳,患者总体预后欠佳,且目前尚无达成共识的标准化治疗方案可供临床使用。因此,寻找新的具有潜在应用价值的治疗手段迫在眉睫。肿瘤分子靶向治疗是选择肿瘤组织或细胞特异性表达或异常性表达的分子为靶点,使用能与这些靶分子特异性结合的药物,特异性地杀伤肿瘤细胞的治疗方式。抗体药物因其靶向性强,副作用小,疗效明显等优点,迅速成为了肿瘤靶向治疗领域中的研究重点。抗体药物靶向治疗的关键在于寻找合适的靶抗原。一个理想的单抗,其靶点应该是在肿瘤细胞表面特异性表达或高表达,而在正常组织中不表达或低表达的抗原。EBV编码的潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1,LMP1）在多种EBV相关恶性肿瘤及淋巴瘤的发生发展过程中发挥重要作用,是目前公认的癌基因。前期研究亦显示LMP1在NKTCL组织中明显高表达,且LMP1与NKTCL某些恶性生物学行为如B symptoms显著正相关,高表达LMP1的NKTCL病人预后不佳。这使得LMP1成为潜在理想的NKTCL靶向治疗标志物。在前期实验中,本课题组已从全人源Fab抗体库中筛选出多株高结合活力抗LMP1-Fab,其中克隆株LMP1-Fab 36号克隆表现出较高的抗原亲和力及中和活性。本研究通过基因工程技术和抗体工程技术,以原LMP1-Fab为模板,构建、表达及纯化具有中和活性的全分子人源抗LMP1-Ig G,并对此全分子LMP1-Ig G进行功能鉴定,同时检测LMP1-Ig G对NKTCL的抑制作用并初步分析其作用机制,为NKTCL的分子靶向治疗提供新的研究方向。研究方法:1.重组抗LMP1-Ig G抗体真核表达载体的构建:优化LMP1-Fab可变区序列,根据Infusion PCR原理设计抗LMP1-Ig G抗体的重、轻链PCR扩增引物。将PCR产物克隆到抗体真核表达质粒p FUSE-CHIg-h G1、p FUSE-CLIg-hk中,转化大肠杆菌DH5α后,筛选阳性克隆并酶切鉴定,对酶切鉴定正确的克隆测序以确认序列连接正确。2.抗LMP1-Ig G抗体的表达、纯化和鉴定:将测序正确的p FUSE-CHIg-h G1-LMP1-VH（p TH-LMP1-VH）、p FUSE-CLIg-hk-LMP1-VK（p TH-LMP1-VK）重组质粒转染到293 Freestyle（293F）细胞中,共培养后收集细胞上清。后使用Protein A亲和层析柱和AKTA蛋白纯化系统纯化抗体。纯化后超滤离心并浓缩,分别使用酶联免疫吸附实验、免疫印迹实验、亲和力检测、免疫组化实验等对抗LMP1-Ig G的结合性、亲和力等进行特性检测分析。3.分别使用MTT和CCK-8法检测LMP1-Ig G对NKTCL细胞系的抑制作用:MTT法:收集对数期NKTCL细胞加入细胞培养板,后加入不同浓度梯度LMP1-Ig G,MTT溶液及二甲亚砜,OD490nm测量各孔吸光值;CCK-8法:在配制NKTCL细胞悬液后加入不同浓度梯度LMP1-Ig G,孵育后加入CCK-8溶液,OD450 nm测量各孔吸光值。4.Annexin V/PI实验检测LMP1-Ig G对NKTCL细胞凋亡的作用:LMP1-Ig G处理NKTCL细胞后胰酶消化,收集悬浮细胞,洗涤后分别使用Annexin V-FITC标记及PI标记,上流式细胞仪检测。5.LDH释放实验检测LMP1-Ig G对NKTCL细胞ADCC及CDC效应:ADCC:NKTCL细胞与不同浓度LMP1-Ig G共培养。收集健康志愿者PBMC后与NKTCL细胞以不同效靶比共培养,OD570nm检测LDH释放值;CDC:NKTCL细胞与不同浓度LMP1-Ig G共培养后分别加入正常人血清及加热灭活人血清,OD570nm检测LDH释放值。6.LMP1-Ig G靶向抑制NKTCL机制研究:使用RNA干扰技术构建LMP1-si RNA质粒并转染NKTCL细胞,检测LMP1-Ig G对NKTCL细胞JAK/STAT信号通路的影响。研究结果:1.抗LMP1-Ig G真核表达载体的构建及抗LMP1-Ig G的表达、纯化及鉴定采用PCR分别扩增出长度360 bp的VH基因和321 bp的VK基因,经Infusion PCR获得p TH-LMP1-VH及p TH-LMP1-VK质粒,转化大肠杆菌后使用293 Free style Expression System真核表达抗LMP1-Ig G。SDS-PAGE结果显示,纯化后的抗体在55k D和25k D左右分别有一条带,分别为抗LMP1-Ig G的重链和轻链。细胞ELISA及Western blot实验显示抗LMP1-Ig G可识别NKTCL细胞中的LMP1抗原。亲和力检测,抗LMP1-Ig G的亲和力KD为3.175×10–9M。免疫组化实验显示抗LMP1-Ig G与商业化LMP1抗体在识别NKTCL组织中LMP1表达无统计学差异。2.抗LMP1-Ig G对NKTCL细胞的靶向抑制作用CCK8及MTT实验分别证明LMP1-Ig G对LMP1阳性表达NKTCL细胞具有明显的杀伤作用,此杀伤作用具有浓度依赖性及时间依赖性,抑瘤率最高可达约40%（CCK8）及60%（MTT）。LMP1-Ig G的IC50值分别为7.421μg/ml（SNK-6细胞）及17.68μg/ml（SNT-8细胞）。Annexin/V PI双染实验显示LMP1-Ig G对LMP1阳性表达NKTCL细胞有促凋亡作用且同样具有浓度依赖性及时间依赖性。LDH释放实验显示20μg/ml的LMP1-Ig G可明显诱导LMP1阳性表达NKTCL细胞出现ADCC效应及CDC效应,而对LMP1阴性表达NKTCL细胞细胞则无明显ADCC及CDC效应。3.抗LMP1-Ig G对NKTCL细胞的抑制作用的机制研究LMP1-Ig G可抑制STAT3磷酸化表达,而对STAT5磷酸化抑制作用不明显;可抑制JAK3磷酸化表达,而对JAK1,JAK2,TYK2磷酸化作用不明显。LMP1-Ig G对JAK3/STAT3磷酸化的抑制作用同样具有浓度及时间依赖性。使用RNA干扰技术构建LMP1-si RNA质粒并转染NKTCL细胞,si RNA成功抑制NKTCL细胞中LMP1的表达且抑制LMP1表达后,LMP1-Ig G对STAT3磷酸化的抑制作用可被拯救。研究结论:1.成功构建全人源抗LMP1-Ig G真核表达载体,表达并纯化后的全分子抗LMP1-Ig G具有较好的生物学活性。2.初步证明本研究制备的全分子抗LMP1-Ig G可抑制NKTCL细胞生长,并发挥ADCC/CDC效应,对LMP1阳性表达的肿瘤具有潜在的靶向治疗价值。3.JAK3及STAT3磷酸化作用可被抗LMP1-Ig G抑制,对JAK3/STAT3信号通路的抑制可能是抗LMP1-Ig G发挥抑瘤作用的机制之一。