多粘类芽孢杆菌SC2发酵条件优化及抑菌物质的分离纯化

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多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类对植物生长有明显促进作用的植物根际促生菌(Plant-growth-promoting rhizobacteria,PGPR),现已广泛应用于农业生产中。多粘类芽孢杆菌SC2分离自辣椒根际,本文对多粘类芽孢杆菌SC2抗细菌活性物质的发酵条件及其培养基配方进行了优化,并对抗细菌活性物质进行了分离纯化,主要内容如下:以阿须贝培养基为基础培养基,通过单因子试验确定了最佳碳源、氮源、以及添加金属离子对抗菌物质产量的影响。通过正交设计,响应面分析,确定抑菌率最大时的最优培养基。最后最适的发酵温度。结果表明蔗糖、硫酸铵为最佳碳氮源。除镁离子外,锰离子、锌离子对多粘类芽孢杆菌SC2胞外抗菌物质的产生均具有抑制作用,最终,确定SC2的最佳发酵培养基配方为蔗糖43.60g/L、(NH42SO4 6.66g/L、CaCO3 6.26g/L、MgSO4 0.2g/L、KH2PO4 0.2g/L、NaCl 0.2g/L,最佳发酵温度为37℃、培养时间为60h。抗菌物质的最终产量提高了大约4倍。为了获得发酵液中较纯的抗菌物质并对其进行鉴定,本研究对其进行了分离纯化。研究主要采用的方法包括萃取得到棕色粗提物,进行高效液相色谱(HPLC)分析。通过分析型HPLC分析,共发现了7个活性峰,保留时间分别为:5.5min、7.5min、9min、12.5min、16min、17.5min、23.5min。对7个活性峰收集并进行质谱分析,确定了多粘类芽孢杆菌SC2产生的代谢产物中除多粘菌素P1、多粘菌素P2外还有五个未知的抗菌活性物质。通过制备型HPLC分析,共发现5个活性峰,保留时间为11.1min、25.1min、27.8min、33.8min、34.9min。将各活性峰收集、浓缩后进行二次液相分离,优化各峰洗脱条件,分离出抗菌活性物质。通过质谱分析技术,对活性物质的含量、分子量及结构进行了分析,结果显示:保留时间为11.1min的活性峰浓缩液经二次分离后得到两个纯度较高的活性峰。经过一级质谱分析确定其分子量分别为1190、1176,与多粘菌素P2、多粘菌素P1分子量相一致。经过二级质谱分析确定其结构分别与多粘菌素P2、多粘菌素P1结构相同。保留时间为34.9min的活性峰浓缩液经二次分离后得到两个活性峰,一级质谱分析确定其分子量分别为1230、1258,结构尚未明确。
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