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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类,其产量及产值在最近几年一直位于淡水养殖鱼类前列。然而当前病害问题已成为制约草鱼养殖业发展的瓶颈,其中由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引发的败血症一直是草鱼养殖过程中的重要疾病。本研究从理论和实际两方面考虑,立足我国国情,以草鱼肾细胞(C.idellus kidney,CIK)为研究对象,开展以发掘草鱼免疫相关基因为目标的转录组研究。以期为今后草鱼相关基因的克隆和草鱼免疫学研究,尤其是草鱼细菌性败血症的发病机理提供重要的基础理念。本研究采用CCK-8和ELISA检测试剂盒分别测定CIK细胞经热灭活嗜水气单胞菌刺激后的细胞活力和相关酶活指标;依据半定量RT-PCR技术确定灭活病原菌刺激CIK细胞的最适浓度和最佳时长,并对该刺激条件下的细胞样品进行转录组测序;利用Illumina测序技术构建了CIK细胞经灭活病原菌刺激后的转录组文库,结合生物信息学分析的方法,探究CIK细胞的抗菌免疫应答机制。主要结果如下:1.在细胞活力测定中,随着刺激时间的延长,CIK细胞数目逐渐减少,细胞活性逐渐减弱,12 h后显现出较强的细胞毒性效应,其活力指数降至0.05以下。2.以MOI=100的灭活病原浓度刺激CIK细胞0、1、3、6、9、12、24 h后,细胞总抗氧化水平、超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性随时间的变化均呈现先显著升高(P<0.05),继而下降,后显著升高(P<0.05)的趋势。表明在受到刺激的早期阶段,CIK细胞启动自身防御机制来抵御病原菌引起的氧化应激,而在刺激中期,细胞总抗氧化水平明显降低,可能是CIK细胞产生过量的活性氧簇,自身抗氧化系统无法抵御氧化应激造成的损伤,从而导致总抗氧化能力下降。3.半定量RT-PCR结果显示,目的基因IFN-γ2和NF-κB2的表达量在不同灭活病原菌浓度和刺激时长下存在差异(P<0.05)。目的基因在灭活病原菌浓度MOI=10,刺激时长为1小时的条件下表达量均较高,在灭活病原菌浓度MOI=10,刺激时长为6小时的条件下表达量均较低;于是选择这两个处理条件下的细胞样品和对照组细胞(未加菌刺激)进行后续的转录组测序工作。4.转录组分析共检测到表达基因30430个,其中已知基因23241个,新基因7189个。三组样品(A,刺激1 h样品组;B,刺激6 h样品组;未刺激对照样品组)共确定有差异表达基因1046个,与对照组相比,A组中566个基因表达上调,165个基因表达下调;B组中453个基因表达上调,183个基因表达下调;321个基因在两个处理组中呈现共同表达。5.利用数据库GO和KEGG对1046个差异基因行使的功能进行分类,发现多个基因参与到受体识别、细胞吞噬、凝血与补体级联反应等固有免疫应答反应中。"ck VS A"与"ck VS B"两个差异基因集中基因GO功能注释率较高的几个条目为:细胞代谢(cellular process和single-organism process)、应激反应(response to biotic stimulus)、细胞组成(cell和cell part)和结合功能(binding);差异基因富集率较高的KEGG代谢通路为:信号转导(Signal transduction)、癌症通路(Cancers:Overview)和免疫系统(Immune system)。功能分类结果表明差异表达基因在病原识别,细胞表面受体信号,免疫防御反应等免疫进程中起重要的调节作用。6.关键免疫功能基因筛选及部分差异基因的qRT-PCR验证通过对"ck VS A"与"ck VS B"两个差异基因集中注释到免疫系统(Immune system)代谢通路中的基因进行表达相关性分析,筛选出12个与免疫功能相关的关键基因。从转录组数据中筛选注释到“免疫系统”代谢通路中的5个差异基因进行qRT-PCR分析,以验证本研究转录组测序结果的准确性。本研究通过RNA-seq的方法对CIK细胞受到灭活嗜水气单胞菌刺激后的转录模式有了一定了解,系统筛选鉴定了CIK细胞中与抗菌应答相关的免疫功能基因及调控通路。我们认为这些重要的免疫相关基因可以为草鱼细菌性败血症的发病机理研究提供重要的参考信息,为草鱼抗病品系的培育提供遗传学参考。