猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是严重影响全球生猪产业的病原,引致以妊娠母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道疾病为特征的猪繁殖与呼吸综合征。PRRSV具有毒株多样性和复杂的致病机制,其感染的靶细胞主要是猪肺泡巨噬细胞(Porcinealveolarmacrophages,PAMs),可引起猪的天然免疫免疫抑制。本研究聚焦于PRRSV感染对PAMs IFN-β表达的影响及其分子机制,分析了基因2型PRRSV不同致病性毒株对IFN-β表达的影响,进一步研究了细胞microRNA对IFN-β3蛋白表达的调节作用以及影响PRRSV不同毒株对IFN-β表达抑制效应的病毒蛋白,以期为阐明PRRSV抑制靶细胞天然免疫的机制提供科学依据。利用Real-time PCR技术,对PRRSV不同致病性毒株感染原代PAMs的天然免疫功能相关分子与病毒受体的mRNA转录及其差异性进行了分析。结果表明,PRRSV早期感染可诱导Ⅰ型干扰素、干扰素刺激基因、多数细胞因子和趋化因子以及PoSn的mRNA转录水平上调;高致病性毒株JXwn06诱导Ⅰ型干扰素、干扰素刺激基因、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、CXCL10、PoSn的mRNA转录上调水平高于低致病性毒株HB-1/3.9,而诱导IL-1α、IL-1β、IL-23p19、CCL3、CCL20、CXCL2、CXCL8、MIF 的 mRNA 转录上调水平低于 HB-1/3.9。利用 Real-time PCR 和定量 ELISA技术,对感染PRRSV不同致病性毒株的PAMs中Ⅰ型干扰素的mRNA转录与蛋白表达水平及其差异进一步分析。结果表明,PRRSV早期感染PAMs的IFN-α和IFN-β mRNA的转录水平上调,但IFN-α、 IFN-β蛋白表达受到抑制,且呈病毒感染剂量依赖性;JXwn06诱导Ⅰ型干扰素mRNA转录上调的水平高于HB-1/3.9,而对Ⅰ型干扰素蛋白表达的抑制作用却强于HB-1/3.9。由此提示,PRRSV感染抑制PAMs的Ⅰ型干扰素蛋白表达是通过转录后抑制机制,且高致病性毒株的转录后抑制效应更强。分析了猪miRNA (let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145)对猪IFN-β蛋白表达的调节作用。双荧光素酶活性检测结果表明,猪let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145能够靶向结合猪IFN-β基因的 3’UTR,结合区域分别为 3’UTR 的 160-181 bp、9-31 bp、27-47 bp、12-32 bp 序列。 miRNA模拟物和抑制剂转染试验结果表明,let-7b、miR-26a、miR-34a和rmiR-145模拟物均能够抑制PAMs分泌IFN-β蛋白,且呈剂量依赖性;let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145抑制剂均能够减弱内源性miRNA对PAMs分泌IFN-β蛋白的抑制作用,且呈剂量依赖性。Poly Ⅰ:C刺激试验结果表明,猪IFN-β蛋白对let-7b、miR-26a、rmiR-34a和miR-145的表达具有负反馈调节作用。由此表明,猪let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145能够通过靶向结合IFN-β基因的3’UTR而抑制IFN-β蛋白表达。利用Real-timePCR技术,分析了 PRRSV不同致病性毒株早期感染PAMs的miRNA表达水平。结果表明,PRRSV早期感染PAMs的let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145表达上调,且JXwn06感染的上调水平高于HB-1/3.9。miRNA抑制剂转染试验结果表明,let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145抑制剂能够减弱PRRSV对IFN-β蛋白表达的抑制作用,并上调IFN-βp蛋白表达。miRNA sensor双荧光素酶活性检测结果表明,NSP1α、NSP1β和NSP2是引起let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145表达上调的主要病毒蛋白,且NSP1β和NSP2是PRRSV不同致病性毒株上调miRNAs水平出现差异的主要病毒蛋白。利用慢病毒包装技术,成功构建并包装了慢病毒LvJn1β、LvJn2、LvHn1β、LvHn2。慢病毒抑制IFN-βp蛋白表达的作用分析结果表明,LvJn1β、LvJn2、LvHn1β、LvHn2均能够显著抑制IFN-β蛋白表达,且LvJn1β、LvJn2对IFN-β蛋白表达的抑制作用分别比LvHn1β、LvHn2更强。由此表明,NSP1β和NSP2是PRRSV不同致病性毒株抑制IFN-β蛋白表达水平出现差异的主要病毒蛋白。比较分析了 28株基因2型PRRSV高致病性毒株和10株低致病性毒株的NSP1β和NSP2氨基酸序列,结果表明,NSP1β和NSP2的2个和14个保守突变氨基酸位点是高、低致病性毒株之间保守的差异氨基酸位点。进一步以JXwn06和HB-1/3.9的全长cDNA克隆为骨架,利用感染性克隆平台和点突变技术,成功构建和拯救了 NSP1β、NSP2单独置换与同时置换各自保守突变氨基酸位点的突变病毒 RvJMn1β97L104N、RvJMn2、RvJMn1β97L104N+n2、RvHMn1β97S104Y、RvHMn2、RvHMn1β97S104Y+n2。 miRNA sensor双荧光素酶活性分析结果表明,NSP1β的保守突变氨基酸位点与PRRSV不同致病性毒株NSP1β上调miR-26a、miR-34a、miR-145的差异有关,而NSP2的保守突变氨基酸位点与PRRSV不同致病性毒株NSP2上调let-7b的差异有关。对突变病毒抑制IFN-β蛋白表达的作用分析结果表明,RvHMn1β97S104Y+n2对IFN-β蛋白表达的抑制作用显著高于 RvJMn1β97L104N+n2,而 RvJMn1β97L104N、RvHMn1β97S104Y 以及 RvJMn2、RvHMn2之间差异不显著。由此表明,NSP1β+NSP2保守突变氨基酸位点与PRRSV不同致病性毒株抑制猪IFN-β蛋白表达的差异有关。综上所述,我们的研究表明:(1) PRRSV感染抑制PAMs的Ⅰ型干扰素蛋白表达是通过转录后抑制机制,高致病性毒株抑制效应强于低致病性毒株;(2)猪miRNAs (let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145)可通过靶向结合IFN-β基因的3’UTR而抑制IFN-β蛋白表达;(3) PRRSV可通过上调let-7b、miR-26a、miR-34a、miR-145而抑制IFN-β蛋白表达,且高致病性毒株上调miRNAs 水平更高;(4) NSP1α、NSP1β 和 NSP2 是 PRRSV 上调 let-7b、miR-26a、miR-34a、miR-145的主要病毒蛋白,且NSP1β和NSP2是引起PRRSV不同致病性毒株上调miRNAs水平与抑制IFN-β蛋白表达水平出现差异的主要病毒蛋白;(5) NSP1β+NSP2保守突变氨基酸位点与PRRSV不同致病性毒株抑制IFN-β蛋白表达的差异有关。研究结果揭示了 PRRSV感染抑制PAMs IFN-β蛋白表达的分子机制,为阐明PRRSV抑制靶细胞天然免疫的分子机制提供了科学依据。