帕金森病（Parkinson’s disease,PD）又称震颤麻痹,是一种以中脑黑质致密部（SN）多巴胺（DA）能神经元选择性死亡和残存的神经元胞浆中出现以α突触核蛋白为主要成分的淀粉样蛋白包涵体-路易小体为主要病理特征的中枢神经退行性疾病。PD病理变化的确切原因尚不清楚,遗传因素和非遗传因素（氧化应激、蛋白聚集、细胞凋亡以及铁的异常聚积等）都可能参与PD发病过程。PD患者的尸检结果以及PD动物模型均显示铁在黑质致密部选择性聚积,因此铁在脑中的过度沉积以及由铁聚积而诱发的氧化应激反应被认为是参与神经变性疾病的主要原因之一。通过调研大量的文献发现,L型Ca²⁺通道不仅介导铁进入PC12,N-2α等细胞系,而且还介导铁进入原代海马神经元及其它神经元,并且铁与钙以相同的途径竞争性的进入上述细胞。这表明,在铁负载的情况下,L型Ca²⁺通道可能与神经退行性疾病如PD的病理发生和发展密切相关。大量研究表明,L型Ca²⁺通道可能通过影响铁离子的进入而影响DA能神经元内的氧化应激,参与PD的发病过程。尽管铁的过度聚积和稳态的破坏与神经变性疾病相关,但铁在PD发病过程中的潜在机制尚未完全清楚。已有报导显示,伊拉地平作为一种可以透过血脑屏障的二氢吡啶类（DHPs）钙通道阻断剂,能够促进DA能神经元的成熟,修复已受损神经元的功能,并且使周围神经元免受已损伤神经元释放的神经黑素的毒性影响。此外,另有证据表明,伊拉地平在PD的动物模型中通过缓解黑质多巴胺能神经元内钙负荷和线粒体代谢压力对神经元起到保护作用,进而减少神经元的损伤。因此我们推测,在铁负载情况下,L型Ca²⁺通道阻断剂有可能通过阻断钙通道的开放缓解神经元内的铁负载,为治疗帕金森病铁损伤提供一个新治疗策略。为探讨PD发病过程中,L型Ca²⁺通道对Fe²⁺诱导的MES23.5细胞毒性中的作用,本实验以MES23.5细胞系为观察对象,应用4-甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞存活率,流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测线粒体膜电位（△Ψm）和活性氧（ROS）的变化,免疫印迹法（Western blot）检测与凋亡相关的Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表达,从而初步评估伊拉地平对Fe²⁺诱导的细胞毒性的保护作用。同时,我们通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测Fe²⁺处理对Cav1.2和Cav1.3型钙通道α1亚基mRNA表达的影响,利用miRNA干扰技术选择性干扰Cav1.2型Ca²⁺通道α1亚基mRNA表达并且建立稳定感染细胞株,利用CCK8检测不同处理组慢病毒感染细胞存活率,流式细胞术检测不同处理组慢病毒感染细胞内ROS变化,利用激光共聚焦显微镜成像技术（Laser scanning confocal microscope）检测不同处理组慢病毒感染细胞胞内铁含量变化,进一步探讨Fe²⁺诱导细胞损伤的可能机制。研究结果如下:1.不同浓度的 Fe²⁺（0、20、40、60、80、100 μmol/L）处理 MES23.5 细胞 4h 后,随着Fe²⁺浓度的不断增加,△Ψm逐渐降低,且具有剂量依赖性,当浓度为40 μmol/L Fe²⁺处理细胞时,与对照组相比,△Ψm约降低13.18%-差异具有统计学意义（P<0.001）。我们选取40 μmol/L的Fe²⁺用于后续实验。2.与对照组相比,单独加Fe²⁺组细胞存活率约为对照组的73.90%,差异具有统计学意义（P<0.001）,而伊拉地平预处理却可以明显提高细胞的存活率,且差异具有统计学意义（P2+组细胞核出现明显的形态学变化如核固缩、碎裂、荧光明亮等现象,差别具有统计学意义（P2+导致的细胞核形态的改变,且差异具有统计学意义（P2+组△Ψm明显下降,大约降低11.2%,差异具有统计学意义（P<0.001）,与Fe²⁺组相比,伊拉地平预处理组△Ψm明显上升,且差异具有统计学意义（P2+组细胞内ROS水平明显上升,是对照组的1.42倍,差异具有统计学意义（P2+组细胞Bcl-2/Bax蛋白表达比值明显降低（P<0.01）,而伊拉地平预处理可改善由Fe²⁺造成的Bcl-2/Bax蛋白比值降低的现象（P<0.05）,差异具有统计学意义。7.与对照组相比,单独加Fe²⁺组细胞Cleaved caspase-3蛋白被明显激活,表达量约是对照组的1.22倍（P<0.01）,而伊拉地平预处理可以缓解由Fe²⁺造成的Cleaved caspase-3蛋白表达的升高（P<0.05）,差异具有统计学意义。8.实时荧光定量PCR检测Cav1.2和Cav1.3型Ca²⁺通道α1亚基mRNA在0、2、4、8h的表达,结果显示,与对照组相比,Cav1.2型Ca²⁺通道α1亚基mRNA表达水平在2、4h时分别上调了 1.40倍和1.24倍,差异具有统计学意义（P<0.001,P<0.05）。Cav1.3型Ca²⁺通道α1亚基mRNA表达水平在2、4 h时与对照组相比分别上调了1.31和1.34倍,差异具有统计学意义（P<0.001,P<0.01）。9.利用慢病毒感染MES23.5细胞,选择性干扰Cav1.2型Ca²⁺通道mRNA的表达。与对照组相比,仅Cav 1.2 shRNA慢病毒载体Y7380组Cav 1.2的mRNA下调约70%,差异具有统计学意义（P2+,Cav1.2 sh-Fe²⁺)细胞存活率的变化。与空载体组相比,40 μmol/L Fe²⁺处理细胞4 h后,细胞存活率明显降低（P<0.001）,而Cav1.2 sh组细胞存活率较Fe²⁺处理组显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。11.与空载体组相比,40 μmol/L Fe²⁺处理细胞4 h后,ROS水平显著增加（P<0.01）,而Cav1.2 sh组细胞中ROS得到一定程度的缓解,差异具有统计学意义（P<0.05）。12.与空载体组相比,100 μmol/LFe²⁺灌流细胞30 min后,钙黄绿素荧光猝灭增加,具有时间依赖性现象,而100 μmol/L Fe²⁺灌流Cavl.2 sh组细胞却可以延缓由Fe²⁺诱导的荧光猝灭,这表明细胞摄取铁的能力减弱,差异有统计学意义。以上结果表明,伊拉地平可以减弱Fe²⁺对MES23.5细胞的毒性作用,其机制可能是通过减少Fe²⁺引起的羟自由基的产生,进而改善线粒体的功能,从而抑制铁引起的凋亡。干扰Cav1.2型Ca²⁺通道mRNA能显著抑制铁对细胞的毒性作用及铁向细胞内的转运,提示L-型Cav1.2 Ca²⁺通道可能参与了铁的异常聚积。