早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性40岁之前卵巢功能发生衰退,以月经紊乱伴有高促性腺激素、低雌激素表现。POI的最新诊治共识提出POI诊断为间隔>4周连续两次FSH(follicular stimulating hormone,卵泡刺激素)>25IU/L。目前中国女性POI的发生率约为2.8%,此病严重危害女性的生理与心理健康,可导致女性发生不孕、骨质疏松、泌尿生殖器官萎缩、心血管及神经系统疾病等。目前半数以上POI患者的病因尚不明确,且临床上缺乏有效的预测及干预措施,因而成为当今妇科、生殖内分泌领域研究的热点与难点。POI的常见病因主要为四大类,包括基因突变、医源性因素、自身免疫因素及一类病因未明的特发性因素。本课题以POI的病因研究入手:(1)遗传性因素:检测TBP2基因(TATA-binding protein 2 gene)外显子在中国汉族特发性POI患者中的突变情况,以分析TBP2基因与POI发生的关系。(2)医源性因素:首先应用顺铂(cisplatin,CP)诱导医源性POI小鼠模型,为探讨miR-125家族与POI的相关性研究提供基础。由于卵泡闭锁是POI的病理特征之一,而卵巢颗粒细胞(granulosa cell,GC)凋亡上升可加速卵泡闭锁,引起POI,因而研究POI发病机制的体外实验常应用GC。因此,我们进一步使用CP诱导小鼠原代卵巢颗粒细胞(mouse granulosa cell,mGC)发生凋亡,以构建化疗致POI的细胞模型,经过体外实验研究miR-125a-5p在致mGC凋亡中的作用及可能机制,进而初步阐述miR-125a-5p在医源性POI发病中可能发挥的作用。(3)免疫因素:自身免疫性卵巢炎(autoimmune oophoritis,AO)属于自身免疫性疾病,是免疫性POI发生的原因。而Treg细胞数目与功能的改变在自身免疫性疾病、AO动物模型及POI患者中已有报道。通过观察Treg细胞内特异性敲除 BPTF(bromodomain PHD finger transcription factor,染色质重塑)基因小鼠的Treg细胞数目、功能改变及卵巢淋巴细胞浸润的情况,初步探讨BPTF基因调控Treg细胞功能的作用及其与免疫性POI之间可能存在的联系。通过上述研究,为明确POI的发病机制提供一定的实验基础,进而有望为临床上POI的早期诊断及干预提供新线索与理论依据。第一部分早发性卵巢功能不全患者TBP2基因的相关性研究目的:有研究提示TBP2基因(TATA-binding protein 2 gene)特异性表达在小鼠卵巢,其敲除小鼠(TBP2-/-)卵巢卵泡发育障碍,发生不孕。本研究对汉族特发性POI患者TBP2基因的7个外显子进行测序,以分析TBP2与特发性POI发生的相关性。方法:对60例特发性POI患者和60例健康女性对照者,采用外周静脉血提取DNA,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增TBP2基因的外显子,并进行测序以检测基因突变情况。应用卡方检验比较单核苷酸多态性位点(single-nucleotide polymorphism,SNP)的基因型及等位基因频率在POI组及对照组间的分布情况。结果:在POI组和对照组中发现1个常见的SNP(rs8019270),位于TBP2基因的1号外显子,符合哈温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)检验。该位点的基因型及等位基因频率在两组间的分布无统计学意义(p>0.05)。结论:TBP2基因可能与POI的发病不相关,可能由于本研究样本例数小,且仅包含汉族POI女性。TBP2功能研究与生殖功能具有相关性,因此需要在更大样本量的不同种族人群中进行TBP2的基因研究,以明确TBP2在POI发病过程中的作用。第二部分 miR-125a-5p在化疗致早发性卵巢功能不全中的作用及机制研究第一节化疗致早发性卵巢功能不全小鼠模型建立及miR-125a-5p 的表达目的:构建顺铂(cisplatin,CP)致卵巢功能衰退的医源性POI动物模型,并检测miR-125家族成员(miR-125a-5p与miR-125b-5p)在医源性POI动物模型中的表达水平。方法:应用3.0mg/kg的CP腹腔注射6-8周ICR小鼠7d,以等量生理盐水为对照组。造模后次日观察小鼠体重、动情周期,卵巢湿重与卵巢系数。应用ELISA法检测小鼠血清E2、FSH和AMH水平。小鼠卵巢及重要脏器,如心、肾、肝和肺进行HE染色。应用Realtime PCR法比较生理盐水对照组与CP实验组小鼠外周血、卵巢组织中miR-125a-5p及miR-125b-5p的表达水平。结果:与对照组比较,实验组小鼠的体重从造模第4天开始下降,动情周期不规则,大多数停滞于动情间期,卵巢湿重及卵巢系数明显下降(p<0.01)。实验组小鼠血清的E2、AMH水平较对照组小鼠降低(p<0.01),而FSH明显升高(<0.01)。卵巢HE染色显示实验组小鼠的卵巢体积缩小,结构紊乱,但心、肾、肝和肺的结构无明显异常。与对照组小鼠比较,实验组小鼠外周血与卵巢组织的miR-125a-5p明显升高(p<0.01),但miR-125b-5p的表达水平无改变(p>0.05)。结论:3.0mg/kg的CP作用7d引起小鼠卵巢功能衰退,但不影响其他重要脏器,是研究医源性POI较好的动物模型。此外,miR-125家族的miR-125a-5p可能与医源性POI相关。第二节 miR-125a-5p在顺铂致小鼠原代卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及机制目的:化疗是引起POI的医源性因素之一,而卵巢颗粒细胞的凋亡与耗竭是该疾病发生的病理特征。微小RNA(microRNA,miRNA)广泛分布于卵巢颗粒细胞,且在卵泡发生及闭锁中发挥重要功能。本文旨在探讨miR-125a-5p在顺铂(cisplatin,CP)致小鼠原代卵巢颗粒细胞(mouse granulose cell,mGC)凋亡中的作用及可能机制。方法:不同浓度CP(0,2.5,5,10,20μg/ml)处理mGC不同时间后(Oh,6h,12h,24h,48h)应用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞活率。10μg/ml CP处理mGC 24h后流式细胞仪检测细胞早期凋亡率、Western blot测定cleaved caspase-3、STAT3与p-STAT3蛋白的表达情况;同时采取放射免疫法检测mGC培养液中的雌孕激素变化;Realtime PCR检测miR-125a-5p水平。利用miR-125a-5p模拟物(miR-125a-5p MI),信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)小干扰片段(small interfering RNA,siRNA)转染mGC,应用流式细胞仪和Western blot检测细胞凋亡情况。应用STAT3过表达质粒(GV230-STAT3)或对照质粒(GV230-control)和miR-125a-5p MI共同转染mGC进行补救实验。采用荧光素酶报告基因实验、Realtime PCR 和 Western blot 验证 miR-125a-5p 与 STAT3 的靶向关系。结果:CP呈剂量与时间依赖降低mGC细胞活率。lOμg/ml CP处理mGC 24h后,早期凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达明显增加(p<0.01),STAT3与p-STAT3蛋白水平明显降低(p<0.01),培养液中雌孕激素水平下降(p<0.01),miR-125a-5p的水平较对照组显著升高(p<0.05)。miR-125a-5p MI或STAT3-siRNA转染mGC后,细胞早期凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达均增高(p<0.01)。与共转染miR-125a-5p MI 及 GV230-control 组比较,共转染 miR-125a-5p MI 及GV230-STAT3组使细胞的早期凋亡率及cleaved caspase-3蛋白明显下降(p<0.01)。荧光素酶报告基因实验发现miR-125a-5p MI下调荧光值(p<0.01)。过表达/抑制miR-125a-5p可降低/增加STAT3及p-STAT3的蛋白水平(p<0.05),但不影响 STAT3 mRNA 表达(p>0.05)。结论:miR-125a-5p通过调控靶基因STAT3促进mGC发生凋亡,可能与CP诱导POI的发生有关。第三部分 BPTF对调节性T细胞的调控及其在早发性卵巢功能不全免疫因素发病中的可能作用探讨目的:自身免疫性卵巢炎(autoimmune oophoritis,AO)表现为淋巴细胞、浆细胞浸润卵巢组织,是免疫性POI发生的原因,属于自身免疫性疾病。调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)是由胸腺细胞分化而来且具有免疫抑制功能,是CD4+T淋巴细胞的亚群,其数量的改变可导致自身免疫性疾病的发生。Treg细胞在AO动物模型及POI患者外周血的改变已见报道。BPTF(bromodomain PHD finger transcription factor,染色质重塑)基因在早期胚胎及胸腺细胞发育中起到关键作用。本研究分析BPTF基因对Treg细胞功能的调控,初步探讨BPTF在免疫性POI发病中的作用。方法:比较Treg细胞内特异性敲除BPTF基因小鼠(FGC:Bptffl/fl)与对照鼠(FGC:Bptffl/wt)胸腺、淋巴结、脾脏内CD4+、CD8+T淋巴细胞数目、Treg/CD4+T淋巴细胞的比值及Treg细胞的数目。应用CD44、CD62L抗体标记FGC:Bptffl/fl与FGC:Bptffl/wt小鼠淋巴结、脾脏内CD4+、CD8+T淋巴细胞,比较CD44highCD62low细胞占CD4+或CD8+T淋巴细胞的比值。同时对Treg细胞分别进行PD-1、CTLA-4及CD25表面染色以检测它们的表达水平。流式细胞仪分选FGC:Bptffl/wt或FGC:Bptffl/fl小鼠的Treg细胞(分别为WTTreg细胞、BPTF-KO Treg细胞)、野生型 C57BL/6 小鼠内效应性 T 细胞(CD4+CD25-responder T cells,Tresp 细胞),体外共培养后检测Treg细胞对Tresp细胞增殖的抑制功能。分离FGC:Bptffl/fl或FGC:Bptfl/wt小鼠卵巢内的淋巴细胞,流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞的数目。结果:与FGC:Bptffl/wt小鼠相比,FGC:Bptffl/fl小鼠胸腺、淋巴结、脾脏内CD4+、CD8+T淋巴细胞数目无差异(p>0.05);脾脏与淋巴结内Treg/CD4+T淋巴细胞的比值及Treg细胞数目降低(p<0.01),但胸腺内比值无统计学差异(p>0.05);脾脏、淋巴结内CD44highCD63low/CD4+T淋巴细胞的比值显著升高(p<0.05);脾脏内CD44highCD62low/CD8+T淋巴细胞的比值升高(p<0 05),而淋巴结内比值无差异(p>0.05)。Treg细胞表面的PD-1与CTLA-4的表达与对照组无明显差异,但CD25表达升高。同时BPTF-KO Treg细胞较WT Treg细胞对Tresp细胞增殖的抑制功能明显减弱。FGC:Bptfafl/fl小鼠卵巢内的CD4+、CD8+T淋巴细胞的数目显著增多(p<0.01 与p<0.05)。结论:BPTF基因的缺失使T淋巴细胞异常激活、Treg细胞数目减少、抑制功能减弱,进而导致卵巢内淋巴细胞浸润,可能造成小鼠发生AO。BPTF缺失可能与免疫性POI的发生有关,但仍需进一步分析卵巢及生育功能,来明确BPTF在疾病中的作用。