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活性氧(ROS)在植物免疫系统中起着重要的作用,它是机体不可缺少的一部分,是机体正常生长、分化和抵抗生物/非生物胁迫所必需的。活性氧对病原菌的生长、发育、增殖和致病性起着至关重要的作用,但过量的活性氧对机体是有害的。目前,对卵菌如引起马铃薯晚疫病的致病疫霉中参与响应ROS胁迫的信号级联机制知之甚少。本文通过生物化学、分子生物学、遗传学及多组学(转录组、蛋白组和蛋白磷酸化)分析,以致病疫霉T30-4为研究对象,解析H2O2胁迫对马铃薯晚疫病病原菌生长、发育和致病力等方面的影响以及致病疫霉对H2O2胁迫的响应机制。通过外源加入H2O2来分析ROS胁迫对致病疫霉生长发育的抑制,同时进行转录组、蛋白质组以及磷酸化组学综合分析病原菌在活性氧胁迫下与TOR信号通路介导的自噬途径之间的联系。本研究主要得到以下结果:
①通过H2O2处理致病疫霉T30-4菌株,发现T30-4菌株的孢子萌发、菌丝生长、附着胞形成和致病力都受到显著的抑制。并且这些表型与TOR抑制剂雷帕霉素处理致病疫霉T30-4菌株的表型相似,都具有剂量依赖关系。H2O2和雷帕霉素的联合处理表现出强烈的协同作用,表明ROS应激与TOR信号通路之间存在着相互联系。
②用半致死浓度的H2O2处理致病疫霉标准菌株T30-4,进行转录组、蛋白质组和磷酸化组测序,多组学的联合分析表明:H2O2胁迫诱导了体内TOR介导的自噬途径。MDC染色结果表明,在H2O2和雷帕霉素联合处理下,自噬体增加。同时,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验进一步证实了组学的分析结果。
③宿主诱导PiTOR沉默的转基因马铃薯对晚疫病表现出高度抗性。通过特异靶向致病疫霉PiTOR的RNAi转基因株系构建及致病性检测,转基因株系对致病疫霉表现出抗性;且在病原菌侵染过程中,转基因株系中PiTOR的siRNA水平均显著性上调表达。
综上所述:TOR介导的自噬参与了致病疫霉对H2O2胁迫的应激响应,且TOR的抑制极显著降低了致病疫霉的营养生长和致病性。PiTOR可作为抗性品种遗传育种的靶标。
①通过H2O2处理致病疫霉T30-4菌株,发现T30-4菌株的孢子萌发、菌丝生长、附着胞形成和致病力都受到显著的抑制。并且这些表型与TOR抑制剂雷帕霉素处理致病疫霉T30-4菌株的表型相似,都具有剂量依赖关系。H2O2和雷帕霉素的联合处理表现出强烈的协同作用,表明ROS应激与TOR信号通路之间存在着相互联系。
②用半致死浓度的H2O2处理致病疫霉标准菌株T30-4,进行转录组、蛋白质组和磷酸化组测序,多组学的联合分析表明:H2O2胁迫诱导了体内TOR介导的自噬途径。MDC染色结果表明,在H2O2和雷帕霉素联合处理下,自噬体增加。同时,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验进一步证实了组学的分析结果。
③宿主诱导PiTOR沉默的转基因马铃薯对晚疫病表现出高度抗性。通过特异靶向致病疫霉PiTOR的RNAi转基因株系构建及致病性检测,转基因株系对致病疫霉表现出抗性;且在病原菌侵染过程中,转基因株系中PiTOR的siRNA水平均显著性上调表达。
综上所述:TOR介导的自噬参与了致病疫霉对H2O2胁迫的应激响应,且TOR的抑制极显著降低了致病疫霉的营养生长和致病性。PiTOR可作为抗性品种遗传育种的靶标。