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大豆多肽具有降低血压、提高免疫力、抗氧化及调节肠道菌群等多重作用,应用前景极为广阔。植物乳杆菌作为人体肠道中定植的一种天然、安全、高效的益生菌,在抑制有害菌繁殖,维持肠道菌群平衡方面发挥重要作用。目前,关于大豆多肽和植物乳杆菌对机体健康的影响多为单独作用的研究,而二者联合作用的研究未见报道。本研究拟以大豆多肽和植物乳杆菌为研究对象,先通过体外试验评价大豆多肽对植物乳杆菌的益生性能,再通过动物试验研究大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠肠道菌群及免疫调节作用的影响,以期为二者的联合应用提供参考依据。结果如下:
1.不同酶制备大豆多肽适宜条件的筛选:本研究以植物乳杆菌的生长状况为参考指标,通过单因素试验和正交实验优化出了碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶制备大豆多肽的水解条件。碱性蛋白酶添加量(E/S)9.0%、底物浓度0.075g/mL、pH值9.0、温度45℃、水解3h制备大豆多肽,此时植物乳杆菌的生长数量为2.39×109cfu/mL,较对照组,菌落数提高了58.15%,较水解因素优化前,菌落数提高了21.33%。中性蛋白酶添加量(E/S)9.0%、底物浓度0.075g/mL、pH值7.0、温度50℃、水解3h制备大豆多肽,此时植物乳杆菌的生长数量为2.32×109cfu/mL,较对照组提高了56.89%,较水解因素优化前提高了24.13%。胰蛋白酶在添加量(E/S)10.0%、底物浓度0.050g/mL、pH值7.5、温度35℃、水解2h制备大豆多肽,植物乳杆菌的生长数量为2.25×109cfu/mL,较对照组提高了55.56%,较水解因素优化前提高了10.22%。通过体外培养试验证实了大豆多肽具有显著的增殖植物乳杆菌的益生作用,显示出大豆多肽潜在的益生元功能。
2.大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠肠道菌群的影响:采用Illumina MiSeq高通量技术对小鼠粪便细菌16S rRNA V3-V4区进行测序,分析小鼠肠道粪便菌群的多样性及物种结构组成情况,以探究大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠肠道菌群的影响。对小鼠肠道菌群多样性进行分析,结果表明大豆多肽联合植物乳杆菌能够提高小鼠肠道菌群多样性及丰富度,且显著优于二者单独作用。对小鼠肠道菌群结构进行分析,各组小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成,且厚壁菌门为第一优势菌群;进一步分析表明,大豆多肽联合植物乳杆菌能够增加乳杆菌属、毛螺旋菌属、罗斯氏菌、瘤胃球菌属、劳特氏菌属、普雷沃氏菌属、Muribaculaceae、阿曼克氏菌属等有益菌属的相对丰度,抑制并降低了链球菌属、葡萄球菌属、志贺埃希氏菌属、不动杆菌属、螺杆菌属、norank_f_Desulfovibrionaceae及肠杆菌属等有害菌的繁殖,其中胰蛋白酶制备的大豆多肽联合植物乳杆菌对增加有益菌群的相对丰度效果较好。
3.大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠免疫水平的影响:通过对小鼠免疫器官指数、碳粒廓清实验、耳朵肿胀法、半溶血指数值(HC50)、溶血分光光度法研究了大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠免疫器重量、巨噬细胞的吞噬能力、迟发型变态反应、溶血素水平及抗体细胞生成数量的影响。结果表明,大豆多肽联合植物乳杆菌能够显著增强小鼠非特异性免疫、细胞免疫及体液免疫,且不同蛋白酶制备的大豆多肽与植物乳杆菌联合具有不同的影响,其中胰蛋白酶制备的大豆多肽联合植物乳杆菌对增强小鼠免疫作用效果最好。
1.不同酶制备大豆多肽适宜条件的筛选:本研究以植物乳杆菌的生长状况为参考指标,通过单因素试验和正交实验优化出了碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶制备大豆多肽的水解条件。碱性蛋白酶添加量(E/S)9.0%、底物浓度0.075g/mL、pH值9.0、温度45℃、水解3h制备大豆多肽,此时植物乳杆菌的生长数量为2.39×109cfu/mL,较对照组,菌落数提高了58.15%,较水解因素优化前,菌落数提高了21.33%。中性蛋白酶添加量(E/S)9.0%、底物浓度0.075g/mL、pH值7.0、温度50℃、水解3h制备大豆多肽,此时植物乳杆菌的生长数量为2.32×109cfu/mL,较对照组提高了56.89%,较水解因素优化前提高了24.13%。胰蛋白酶在添加量(E/S)10.0%、底物浓度0.050g/mL、pH值7.5、温度35℃、水解2h制备大豆多肽,植物乳杆菌的生长数量为2.25×109cfu/mL,较对照组提高了55.56%,较水解因素优化前提高了10.22%。通过体外培养试验证实了大豆多肽具有显著的增殖植物乳杆菌的益生作用,显示出大豆多肽潜在的益生元功能。
2.大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠肠道菌群的影响:采用Illumina MiSeq高通量技术对小鼠粪便细菌16S rRNA V3-V4区进行测序,分析小鼠肠道粪便菌群的多样性及物种结构组成情况,以探究大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠肠道菌群的影响。对小鼠肠道菌群多样性进行分析,结果表明大豆多肽联合植物乳杆菌能够提高小鼠肠道菌群多样性及丰富度,且显著优于二者单独作用。对小鼠肠道菌群结构进行分析,各组小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成,且厚壁菌门为第一优势菌群;进一步分析表明,大豆多肽联合植物乳杆菌能够增加乳杆菌属、毛螺旋菌属、罗斯氏菌、瘤胃球菌属、劳特氏菌属、普雷沃氏菌属、Muribaculaceae、阿曼克氏菌属等有益菌属的相对丰度,抑制并降低了链球菌属、葡萄球菌属、志贺埃希氏菌属、不动杆菌属、螺杆菌属、norank_f_Desulfovibrionaceae及肠杆菌属等有害菌的繁殖,其中胰蛋白酶制备的大豆多肽联合植物乳杆菌对增加有益菌群的相对丰度效果较好。
3.大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠免疫水平的影响:通过对小鼠免疫器官指数、碳粒廓清实验、耳朵肿胀法、半溶血指数值(HC50)、溶血分光光度法研究了大豆多肽联合植物乳杆菌对小鼠免疫器重量、巨噬细胞的吞噬能力、迟发型变态反应、溶血素水平及抗体细胞生成数量的影响。结果表明,大豆多肽联合植物乳杆菌能够显著增强小鼠非特异性免疫、细胞免疫及体液免疫,且不同蛋白酶制备的大豆多肽与植物乳杆菌联合具有不同的影响,其中胰蛋白酶制备的大豆多肽联合植物乳杆菌对增强小鼠免疫作用效果最好。