类固醇类化合物会引起人和某些动物的生殖障碍、畸形、机体发育异常和癌症等疾病,它可能成为21世纪人类生殖健康所面临的最大挑战。而睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种以类固醇类化合物为碳源的微生物。其3,17β-羟基类固醇脱氢酶(3,17β-HSD)是诱导降解类固醇类化合物的关键酶,位于3,17β-HSD下游的TetR编码的蛋白可能作为3,17β-HSD的调控因子,抑制3,17β-HSD基因的表达,降低对类固醇分解作用。本研究尝试构建TetR基因的突变菌株,分析TetR与3,17β-HSD的调控关系;同时构建TetR基因表达载体,分析其活性蛋白与3,17β-HSD调控序列的结合位点。研究睾丸酮丛毛单胞菌TetR与3,17β-HSD表达调控关系对利用微生物降解的原理治理环境激素污染起到重要作用。实验主要分为两大部分,第一部分是:构建含有331 bp TetR突变基因的pK18-TetR载体,利用基因重组方法获得TetR基因的突变菌株,通过分光光度法分析突变菌和野生菌的生长趋势变化,并对睾丸酮诱导下野生菌与突变菌中3,17β-HSD表达及遗传稳定性进行分析,初步明确TetR与3,17β-HSD的调控关系;第二部分是:将660 bp TetR基因克隆进pET-15b的表达载体中,优化蛋白提取条件,获得活性TetR蛋白。进一步利用凝胶迁移实验(EMSA)和金纳米粒子(AuNPs)光吸收法分析TetR蛋白与3,17β-HSD基因上游中的结合位点,并尝试用睾丸酮解除TetR蛋白阻遏效应。研究结果:1)成功构建TetR基因敲除突变菌株。且突变菌和野生菌生长趋势相差不大,突变菌具有良好的生物稳定性。在睾丸酮诱导下的突变菌中3,17β-HSD表达量增强,从反向遗传学证明TetR蛋白是3,17β-HSD的抑制子,且突变菌具有良好的遗传稳定性。2)成功构建了pET-15b-TetR表达载体,并提取了TetR活性蛋白,其与3,17β-HSD回文序列可以特异性结合,对两段回文序列均具有较好结合力,结合能力回文序列2>回文序列1,可能是具有协同效应。睾丸酮与TetR蛋白结合后可以解除TetR蛋白对回文序列的结合,即解除TetR蛋白对3,17β-HSD表达的阻遏效应。TetR作为3,17β-HSD的阻遏蛋白,可以与3,17β-HSD调控序列中的两段重复序列结合降低其表达量,睾丸酮可以解除TetR对3,17β-HSD的阻遏效应,调控机理符合乳糖操纵子模型理论,TetR突变菌有良好的遗传稳定性,具有应用于类固醇类污染的环境治理的潜力。