【摘 要】
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CRISPR/Cas9系统是由细菌与古生菌编码的适应性免疫系统,S.pyogenes Cas9属于Type II-A型CRISPR/Cas系统,包括CRISPR RNA(crRNA),反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)和Cas9蛋白。
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CRISPR/Cas9系统是由细菌与古生菌编码的适应性免疫系统,S.pyogenes Cas9属于Type II-A型CRISPR/Cas系统,包括CRISPR RNA(crRNA),反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)和Cas9蛋白。短的外源DNA片段插入到CRISPR基因座中,然后转录并加工成crRNA,crRNA和tracr RNA形成与目的DNA互补的双链RNA结构并介导Cas9对标靶DNA的切割。为了使CRISPR/Cas9更好的应用于基因组工程,将crRNA和tracrRNA融合形成single-giude RNA来介导Cas9对双链DNA进行定点编辑。目前CRISPR/Cas9已经成为基因组编辑和基因调节中的最常见并且最有力的工具。但是S.pyogenes Cas9的活性一旦开启就无法关闭。那么如何减少S.pyogenes Cas9过度激活或者长时间活性带来的基因编辑脱靶效应,以及如何对S.pyogenes Cas9的活性精确控制,是目前具有挑战性的科学问题。本研究首先利用原核表达系统表达并纯化出S.pyogenes Cas9-的野生型和活性位点突变型蛋白,接着通过体外组装和纯化获得S.pyogenes Cas9-sgRNA以及S.pyogenes Cas9-sgRNA-dsDNA复合物。在此基础上,本研究从3 000多种化合物中筛选得到12种能够抑制S.pyogenes Cas9活性的小分子抑制剂。并进行了抑制剂抑制机制的研究,通过GST-Pulldown,EMSA实验发现其中包括CAS编号为107 316-88-1、25 535-16-4、34 157-83-0、545-47-1、519-23-3和1 617-53-4的6种小分子抑制剂通过抑制S.pyogenes Cas9蛋白与DNA的结合发挥作用,而另外6种包括CAS编号为518 058-84-9、48 208-26-0、6 902-91-6、2 610-5-1、1 001 645-58-4和137-66-6的小分子则通过不同的机制实现对S.pyogenes Cas9蛋白活性的抑制作用。本研究提供能够抑制S.pyogenes Cas9的核酸酶活性的小分子抑制剂,有助于CRISPR/Cas9抑制剂的开发,并且对CRISPR/Cas9技术进一步推广有着重要意义。
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