RNAi技术抑制萝卜过氧化物酶rsprx1基因表达的初步研究

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过氧化物酶参与植物生长的整个生命过程,包括花青素代谢。在本实验室已研究过氧化物酶与花青素关系的基础上,为了进一步探讨过氧化物酶对花青素的作用机理,本实验以“心里美”萝卜过氧化物酶rsprx1基因为目的片段,构建含有rsprx1基因正反义片段的植物双元表达载体pART-rsprx1i,通过农杆菌介导,用注射的方法在萝卜播种后的第65天进行转染,此后每3天取一次样观察生长期rsprx1基因的抑制情况,并同时以含有空质粒pART27的农杆菌及清水做对照组,检测相关指标,获得以下主要结果:1、抗氧化酶类:过氧化物酶:在整个实验期,pART-rsprx1i组的POD活性始终低于两个对照组,注射后第21天时POD活性达到最低值(9.82×103U/g·FW),与两个对照组相比有极显著性差异(p<0.01),干扰载体对rsprx1基因的最大抑制效果发生在实验后期。过氧化氢酶:从注射后的第12天开始,pART-rsprx1i组的CAT活性开始明显高于两个对照组,并具有极显著性差异(p<0.01)。由此证明在过氧化物酶活性较低的情况下,植物体内会产生更多的过氧化氢酶来消除过剩的自由基。H2O2:pART-rsprx1i组H2O2含量始终高于清水组,并从第6天开始有极显著性差异(p<0.01);pART-rsprx1i组H2O2含量略高于pART-27组,在第18和21天时有一般显著性差异(p<0.05)。可溶性蛋白:可溶性蛋白在注射后的第18天开始下降,pART-rsprx1i组在第21天达到最低值,且与对照组相比有极显著性差异(p<0.01),rsprx1基因的抑制对其的影响主要发生在实验后期。2、花青素:pART-rsprx1i组花青素含量的积累高于对照组,在处理后第9天及第12天达到峰值,且与对照组相比有极显著性差异(p<0.01);高效液相分析结果表明pART-rsprx1i组的花青苷在种类和含量上与对照组相比均有差异。3、相关基因的RT-PCR:在pART-rsprx1i组,rsprx1基因表达明显弱于对照组。处理后第9天时抑制组的花青素合成基因CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX表达显著高于对照组,与TT8和MYB75变化趋势相一致。通过对rsprx1基因抑制,过氧化物酶能参与花青素的代谢途径,rsprx1能够在分子及花色苷合成水平上影响花青素的积累,对过氧化氢酶活性的升高、可溶性蛋白及H2O2含量也有一定的影响。
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