第一部分 超声预测模型的建立及对妊娠早期不良结局的预测价值研究背景自然流产(Spontaneous Abortion,SAB)是指妊娠不足28周,体重不足1000g而出现的非人为目的的妊娠丢失,关于流产的期限目前存在争议,其中80%以上为早期自然流产。研究表明,15%-30%的妊娠在早期发生自发性流产[1],在生殖健康越来越受重视的今天,早期自然流产给患者及家庭带来很大的痛苦和伤害,尤其是胚胎停育进而发展为稽留流产造成的宫腔感染、宫腔粘连,严重影响了患者的身心健康及再次妊娠的结局,因此,为了减轻患者的焦虑、避免医疗资源浪费、改善再次妊娠的结局,及时预测胚胎的发育潜能、识别胚胎停育、预估妊娠结局具有重要的临床意义。随着超声影像学的发展,经阴道超声检查逐渐成为评价胚胎及胎儿发育潜能的重要检测手段,比如定期检测孕囊大小、卵黄囊大小、胚芽、胎心率对妊娠早期胚胎发育潜能的预测具有重要意义[2],有研究提出胚芽与妊娠囊比例太大提示胎盘受损,但没有提出确切的比值[3],对于其它研究指标各家研究结论也不尽相同,甚至存在争议和不确定,没有达成共识,没有统一的测量孕周及统一的测量方法,且大都是单项指标或两项指标的联合预测,预测准确性差,仍需要后期重复检查才能明确诊断。目前国内外缺乏统一的、敏感度高的超声预测模型以供参考,无法及时准确的预测妊娠早期结局。本研究试图在研究孕囊大小、卵黄囊大小、胎心以及胚芽与妊娠囊比值各单项指标的基础上,将该四项超声指标综合,建立一个以评分为标准的预测模型,统一测量孕周、统一测量方法,明确检查的时间点,提高预测的准确性,避免反复多次检查,其意义在于患者妊娠后第一次行常规超声检查时即可比较准确预测妊娠早期结局,及时识别胚胎停育,及时终止妊娠,预防后期因稽留流产造成的身心伤害、减少医疗资源的浪费,同时还可以给具有保胎价值的患者较为肯定的回答,减轻患者的焦虑情绪。研究目的1.通过测量评估单项超声指标,分别研究各超声指标对妊娠早期妊娠结局的预测价值。2.将超声各项指标综合制成超声评分预测模型,统一测量孕周及测量方法,确立一种敏感度高,可操作性强的预测模型,以便在患者孕后第一次常规超声检查时即可及时的识别胚胎停育、预测妊娠早期胚胎的发育潜能,避免反复多次随访观察,从而达到节约医疗资源、减少或避免不良妊娠结局带来的后期并发症,进而提高生殖健康、改善下周期妊娠结局的目的。研究方法1.研究对象因助孕患者病历资料齐全,随访依从性好,孕周计算准确,故入选滨州医学院附属医院生殖医学科208例 IVF/ICSI(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection,体外受精/卵母细胞浆内单精子注射)助孕妊娠患者为研究对象,所有患者均于HCG日注射HCG(human chorionic gonadotropin,人绒毛膜促性腺激素),36-37小时后取卵,形成D3胚胎后进行移植,新鲜周期不适合移植者进行冻融胚胎移植,以移植后33-35天(孕48-50天)为时间点进行第一次阴道超声检查,后定期复查超声,持续妊娠的随访至妊娠14周。2.检测内容及方法采用GEVolusonS6超声检测仪器,探头频率5-6MHZ,患者排空膀胱,取截石位,阴道超声探头涂抹耦合剂,缓慢放入阴道后穹隆,分别做纵向、横向、斜面扫查,测量妊娠囊大小、胚芽大小、卵黄囊大小、胎心是否出现这几项指标,计算胚芽与孕囊比例,每一项指标按照不同的标准分组,分别计算各指标各组间的持续妊娠率及自然流产率。所有超声指标的测量均为同一名经过培训合格上岗的超声医师操作。妊娠囊大小取两个径线的平均值(一条径线为最大内径,另一条径线为与该内径垂直的最大内径);胚芽取最大径线测量头臀长度;卵黄囊取最大径线的内侧缘距离;胎心的出现是B超下肉眼见到胎心搏动或检测到血流信号。3.超声预测模型的建立按照各项指标中持续妊娠率高的参数得高分,持续妊娠率低的参数得低分,将妊娠囊、胚芽与妊娠囊的比值、卵黄囊的大小、以及胎心出现与否这四项指标按照不同的参数标准制成评分体系,各项指标的综合评分最高得9分,最低得4分。每一位被研究对象再按照评分体系得分,再将评分8分及9分的按年龄不同进行分组,分别分析各年龄组的持续妊娠率。研究结果208例患者,平均年龄为30.89岁,各组间年龄、体重指数、既往自然流产次数均无统计学差异,妊娠14周总的持续妊娠率是78.85%(164/208),自然流产率是 21.15%(44/208)。1.超声单项指标对早期妊娠结局的预测价值(1)妊娠囊各组间持续妊娠率的比较,妊娠囊>21mm组,持续妊娠率高达94.74%,16-21mm组,持续妊娠率为90.48%,<16mm组,持续妊娠率为33.3%,>21mm与16-21mm两组比较无统计学差异(P>0.05),其余各组间比较均有统计学意义(P<0.05)。(2)胚芽与妊娠囊的比值各组间持续妊娠率的比较,胚芽/妊娠囊>0.25组,持续妊娠率100%,胚芽/孕囊0.10-0.25组,持续妊娠率90.63%,胚芽/妊娠囊<0.10组,持续妊娠率60%,胚芽未出现,持续妊娠率为0,胚芽/妊娠囊>0.25与胚芽/妊娠囊0.10-0.25两组无统计学意义(P>0.05),其余各组比较均有统计学意义(P<0.05)。(3)不同卵黄囊大小各组间持续妊娠率的比较,卵黄囊大小在2-6mm组,持续妊娠率85.42%,卵黄囊<2mm组(包括没有卵黄囊的)16例,自然流产率100%,持续妊娠率为0,两组比较有统计学意义(P<0.05)。(4)胎儿心脏的出现与否两组间持续妊娠率的比较,有胎心组妊娠早期持续妊娠率为90.91%,无胎心组持续妊娠率12.50%,两组比较有统计学意义(P<0.05),其中无胎心组再分成两组,有胎芽无胎心组8例,持续妊娠率50%,无胎芽无胎心的共24例,无1例存活。2.超声预测模型的建立及对妊娠早期不良结局的预测价值(1)超声预测模型的建立,基于上述研究,建立了依据妊娠囊大小、卵黄囊大小、胚芽与妊娠囊比值、胎心是否出现作为指标的评分体系预测模型以预测早期妊娠结局,每项指标的每个参数按照持续妊娠率的高低得分不同,各项指标的综合得分为4-9分不等,最低4分,最高9分。(2)依据超声预测模型,对208例患者进行妊娠早期胚胎评分,并随访妊娠结局。评分4分、5分、6分、7分、8分、9分的持续妊娠率分别为0(0/16)、33.33%(4/12)、50.00%(8/16)、60.00%(12/20)、96.3%(104/108)、100%(36/36)。获得9分的36例,无1例流产,获得4分的16例无1例存活。随着评分的增高,持续妊娠率逐渐增高,持续妊娠与总妊娠拟合度也越高,自然流产率越低。(3)ROC曲线分析得出该预测模型的AUC(曲线下面积)为0.925,并得出正常与异常的最佳临界值是7.5分,在该模型中表示持续妊娠与自然流产的最佳临界值是7.5分,<7.5分(4-7分)的总的持续妊娠率为37.50%(24/64),>7.5分(8-9分)总的持续妊娠率为97.22%(140/144),卡方检验进一步验证,得出两组比较有统计学意义(P<0.05)。(4)既往有复发性流产(recurrent spontaneous abortion RSA)史合并不孕的患者44例,其中评分8-9分的共32例,获得持续妊娠的32例,持续妊娠率100%。(5)按照年龄大小将评分8-9分的患者分为3组,年龄<35岁,评分8-9分的共112人,其中持续妊娠的112人(持续妊娠率100%);年龄35-40岁,评分8-9分的共20人,其中持续妊娠的20人(持续妊娠率100%);年龄>40岁,评分8-9分的12人,其中持续妊娠的8人(持续妊娠率66.67%)。结论1.本研究得出各单项指标对妊娠早期结局的预测参数:孕48-50天(移植后33-35天),妊娠囊>16mm,胚芽/妊娠囊≥0.10,卵黄囊2-6mm,胎心的出现均预示好的妊娠结局,反之,则预示胚胎停育。此孕周,如果没有胚芽,继续保胎意义不大。如果有胚芽、即使没有胎心,需要继续随访。2.ROC曲线分析得出该预测模型的AUC为0.925,说明该预测模型准确性较高,可于孕48-50天(移植后33-35天)第一次行常规超声检查时即可比较准确地预测妊娠早期胚胎的发育潜能,评分越低胚胎发育潜能越差,对于妊娠早期胚胎发育不良的患者,可以作为临床医生决定终止妊娠的参考标准。ROC曲线及卡方检验均提示持续妊娠与自然流产的最佳临界值是7.5分,具体指导意义如下:7.5分以下流产率升高,在4-7分之间,随着分数的降低,流产率越来越高。8分、9分预示好的妊娠结局,可以给患者较为肯定的回答。3.对于既往有复发性流产史或高龄患者,该预测模型同样具有预测价值。第二部分 FMR1基因序列扩增与妊娠早期自然流产的关系探讨研究背景自然流产的预防和治疗多涉及其病因诊断,临床诊疗共识认为2次及以上自然流产史的患者须积极寻找病因,探索其病因和发生机制是预防和治疗再次自然流产、改善妊娠结局、提高抱婴率的关键。本部分研究旨在深入到自然流产的病因研究,妊娠早期自然流产的病因错综复杂,包括遗传、解剖、感染、免疫学、血液学和内分泌相关因素,但仍有一部分自然流产患者找不到确切的原因,胚胎染色体异常是导致妊娠早期自然流产的最常见原因,然而胚胎染色体异常的发生机制却不是很清楚。近年来很多研究把分子水平的事件与病理学表现联系起来,在分子水平进行自然流产的病因学解释。如研究证明MAD2、MAD1、BUB3、NOG、STOT4等基因通过不同的分子机制促使了自然流产的发生[4-7],但研究仍处在初步阶段,很多自然流产的病因仍然无法解释,有关自然流产病因的分子水平研究还需要一个漫长而复杂的过程,新的基因突变的作用机制在不断的发现中。人类生命过程是多基因表达调控的过程,卵子、合子、胚胎发育的每个停滞点都可能有基因的突变,基因突变、基因表达调控失调会导致生命的不相容,进而导致流产[8]。Hanzlik 研究发现 FMR1(fragile-X mental retardation 1,脆性 X智力低下1)基因广泛存在于人类11周的胚胎组织中,在20周胚胎的一些组织也有表达[9],FMR1基因及其同源基因在胚胎发育过程中多组织的表达,具有组织特异性和时间特异性,说明这些基因参与胚胎发育过程的调节,可能在胚胎发育过程中起重要的指导作用[10],因此该基因的扩增及突变可能导致机体发育过程中疾病的发生。研究证实,脆性X综合征、POF(premature ovarian failure,卵巢早衰)、FXTAS(fragile X trembling ataxia syndrome,脆性 X 相关的震颤性共济失调综合征)是与FMR1基因CGG序列扩增相关的不同疾病,每一种疾病的不同特征在于扩增程度的不同[11]。同一个基因不同位点突变表型不同,同一表型可由不同的基因突变引起,FMR1基因在生命发育过程中的调节作用及FMR1基因突变与POF的相关性提示我们FMR1基因扩增甚至突变是否与自然流产相关?。本研究试图通过研究自然流产史患者中FMR1基因CGG序列扩增情况,初步探讨FMR1基因CGG序列扩增与自然流产的关系,从而为解释一部分自然流产的病因提供新的思路。研究目的因研究发现FMR1基因可能在胚胎发育中起重要调节作用,本课题旨在通过研究自然流产史患者中FMR1基因CGG序列扩增情况,从而探讨FMR1基因CGG序列扩增与自然流产的关系,为自然流产发生分子机制研究提供新的思路。研究方法病例组由2014年1月1日至2016年12月31日期间从滨州医学院附属医院生殖医学科门诊确诊妊娠早期自然流产史的57例患者组成,对照组由滨州医学院附属医院生殖医学科门诊进行健康查体的57名女性组成,年龄差距2岁以内。本研究通过提取外周血DNA,PCR扩增,采用琼脂糖凝胶电泳获取目的基因,采用双脱氧链终止法进行基因测序,以精确测出FMR1基因CGG序列重复的数目,阳性阈值设置为重复40次,41-54重复的存在被称为“灰色区”或中间区域,从55到200的扩增被称为前突变,比较两组人群阳性标本(CGG序列重复>40次)的发生率有无统计学差异。再将病例组及对照组共114例均进行测序分析,比较两组人群FMR1基因CGG序列重复次数有无差别。研究结果1.病例组中的女性有2到5次自然流产(平均2.52±0.63)。流产2次的妇女比例为59.6%,流产3次的比例为29.8%,流产4次比例为8.8%,流产5次比例为1.8%,每名妇女流产的次数与CGG重复次数无关(Kruskal-Wallis检验,P=0.255)。2.结果发现阳性(CGG重复>40次)人数共5名,均为“灰色区”(CGG序列重复41-54次)携带者,其中病例组4名,重复次数分别为42,44,44,47,对照组仅有1名女性被确定为携带具有46次重复(扩增)的等位基因。统计分析发现两组的“灰色区”发生率没有差异(卡方,P=0.364)。3.将病例组及对照组共114例均进行CGG重复序列测序,统计学分析发现病例组CGG序列重复次数高于对照组,两组之间有显著差异(Mann-Whitney检验,P=0.027)。结论病例组女性的FMR1基因CGG重复次数明显高于对照组提示FMR1基因的CGG序列扩增可能与妊娠早期自然流产有关,这种关联是偶然的还是具有因果关系的,未来可以通过更大的患者样本、更先进的技术来研究证实。