本实验室从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离获得一种碱性磷脂酶A<,2>，命名为Gln49-磷脂酶A<,2>(Gln49-PLA<,2>)。该磷脂酶A<,2>具有肌肉毒性、细胞毒性和神经毒性，但检测不到水解磷脂酰胆碱的催化活性。本论文工作的目的就是研究Gln49-PLA<,2>催化活性缺失的原因与机理，并进一步研究其结构与功能的关系。 通过对Gln49-PLA<,2>进行生物信息学分析和三级结构模拟，发现该蛋白质的酶催化活性缺失的原因可能是Gln49-PLA<,2>的第49位氨基酸残基由保守的Asp突变为Gin，造成该位点与钙离子的电荷不相容从而干扰了酶与钙离子的结合。 为了探讨Gln49-PLA<,2>酶结构与功能的关系，论文研究将Gln49-PLA<,2>第49位Gln残基的编码基因分别进行定点突变，突变氨基酸残基分别为Asp、Lys ，然后以pET-32a(+)为表达载体，构建包括(His)<,6>分离标签的融合蛋白重组质粒fQ49D-PLA<,2>和fQ49K-PLA<,2>，转化大肠杆菌BL21(DE3)，以包涵体形式表达重组蛋白。 采用固定金属离子亲和层析(IMAC：Immobilized Metal Affinity Chromatography)方法从含有目的融合蛋白的包涵体颗粒中分离纯化并同时复性、折叠获得目的融合蛋白fQ49D-PLA<,2>。在优化分离、纯化条件下：缓冲液pH8.9、NaCl浓度0.5mol/L、咪唑浓度5mmol/L、GSH/GSSG1：1(1mmol/L)，fQ49D-PLA<,2>收率最高，每升培养基可达到6.889mg，同时融合蛋白比酶活达到36U/mg。 利用蛋白水解酶Factor Xa体外切除融合蛋白fQ49D-PLA<,2>的融合部分，采用HitrapSP阳离子交换层析和Superdex 75凝胶层析纯化，得到突变体蛋白Q49D-PLA<,2>，酶活检测结果显示Q49D-PLA<,2>酶活可达72U/mg。 采用以上三步分离、纯化方法，从融合蛋白fQ49K-PLA<,2>得到突变蛋白Q49K-PLA<,2>，而Q49K-PLA<,2>的酶活几乎检测不到。 总之，这些结论为研究Gln49-PLA<,2>结构与功能的关系提供了直接依据。