心血管疾病是临床上常见的威胁人类健康与生命的重要疾病。多种心血管疾病的最终结果均是心力衰竭,心室重构是导致心力衰竭的主要病理生理学机制。近年来尽管随着对心血管疾病早期干预、早期诊断和治疗手段的发展,其发病率呈下降趋势,急性期患者救治率也明显提高,但仍然有相当数量的患者由于存在进行性心室重构,最终发生慢性充血性心力衰竭。深入探讨心肌损伤后心室重构以及进展至心衰的免疫学发病机制,是提高心血管疾病防治效果的必要前提。自身免疫作用是促进持续的心肌免疫炎症、心肌纤维化和病理性重构的重要因素,但其病理生理机制仍不明了。心肌细胞内的蛋白成分在胚胎发育阶段很少与免疫系统接触,常被称为“遮蔽性抗原”,如心肌肌球蛋白、心肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白等。心肌细胞出现损伤时,细胞内的这些蛋白释放到血液循环中,可能刺激机体免疫系统产生抗心肌抗体。我们及其他研究者发现,多种心脏疾病患者的外周血中均存在心肌肌钙蛋白I自身抗体(Cardiac Troponin I autoantibody,c Tn IAAb)。现有研究结果显示,c Tn IAAb除了可能对临床心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I,c Tn I)的检测产生严重负性干扰、影响患者病情判断之外,还可能引起心功能的持续损伤;c Tn IAAb可能通过与心肌细胞膜上表达的c Tn I结合而引起心脏收缩功能障碍。但是c Tn AAb是引起心肌功能损伤的主要诱因还是仅仅为心肌损伤发生和进展中的标记物?c Tn IAAb如何结合至心肌细胞膜、通过何种机制引起心脏功能损伤仍不清楚;c Tn IAAb与临床疾病进展及患者预后的关系仍需要进一步的研究探索。2012年我们在121名急性心肌梗死(Acute myocardiac,AMI)患者中研究c Tn IAAb发病率及对当时各大c Tn I检测系统的负性干扰时,观察到c Tn IAAb阳性的AMI患者预后更差的现象,其中1名c Tn IAAb滴度最高的患者因为反复心梗导致心力衰竭并在住院期间死亡。在本课题中,我们在以前研究工作的基础上,继续筛查了131名AMI患者c Tn IAAb,并跟踪评价了c Tn IAAb与AMI患者左室重构的关系;严格选择了跟踪1年左右之后,出现心室重构(左心室收缩末期容积增加大于15%)的c Tn IAAb阳性AMI患者,用大肠杆菌表达的重组c Tn I全长蛋白耦联CNBr-activated Sepharose4B亲和层析柱,从患者血清中亲和层析获得了最可能导致患者心功能损伤的人c Tn IAAb,并制备了3株c Tn I单克隆抗体(c Tn Im Ab N1、c Tn Im Ab N2、c Tn Im Ab N3),以c Tn Tp Ab、c Tn Tm Ab和Ig G为对照,探索研究c Tn IAAb与心肌细胞膜直接接触引起心脏功能障碍的致病机制。本研究分为六个部分:第一部分研究目标为跟踪评价AMI患者中c Tn IAAb和左室重构之间的关系,并获取发生左室重构的c Tn IAAb阳性AMI患者血清,以期得到最可能导致AMI患者心脏左室重构的c Tn IAAb,为后续实验研究c Tn IAAb的功能奠定基础。在本研究中有131名AMI患者纳入研究。患者血清样本全部采用间接酶联免疫吸附实验检测c Tn IAAb,患者在入院和出院1年左右检测超声心动图评估左室重构。本部分研究结果显示:131名AMI患者中c Tn IAAb阳性率为17.56%(23/131)。131名AMI患者中有90人[19(c Tn IAAb阳性)VS 79(c Tn IAAb阴性))跟踪到了心脏超声波数据,且19名AMI患者发生了左室重构。经过两分类Logistic回归分析,有2个变量为AMI患者左室重构的潜在危险因素,分别是BNP峰值(OR:1.001,95%CI:1.000-1.002,p:0.028)、c Tn IAAb(OR:3.552,95%CI:1.148-10.989,p:0.028)。19名发生了左室重构的AMI患者中有10名c Tn IAAb阳性和9名c Tn IAAb阴性。这10名发生了左室重构的c Tn IAAb阳性患者血清,可供后续研究使用。第二部分研究目标为从第一部分研究中获得的c Tn IAAb阳性AMI患者血清中纯化出c Tn IAAb,并证实其可与c Tn I特异性结合。在本部分实验中我们首次报道:从c Tn IAAb阳性AMI患者中获得了约36ml患者血清,并成功地纯化出2.24mg(0.8ml,2.8mg/ml)c Tn IAAb。采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分离该纯化蛋白的条带主要在20KD和50KD附近,与免疫球蛋白相吻合;采用间接免疫荧光、间接免疫组化和Western Blotting技术证实,纯化的c Tn IAAb可以特异性识别人、大鼠、小鼠心肌组织中c Tn I,还可与大鼠乳鼠心肌细胞膜的某个蛋白相结合。由于本部分研究获得的c Tn IAAb是从10名c Tn IAAb阳性且发生左室重构的AMI患者血清中提取的,结合文献报道c Tn IAAb与AMI预后差和心功能障碍有关,我们推测纯化的c Tn IAAb也与这些患者LEDV明显增加有关,是具有致病理作用的。但是这需要更明确的实验数据加以证实。第三部分研究目标为采用体外实验的策略,模拟c Tn IAA与心肌细胞直接接触的微环境,重点研究纯化的人c Tn IAAb与原代SD大鼠乳鼠心肌细胞共培养后,心肌细胞出现肥大、凋亡和自噬状态的变化,以验证我们的科学假设。本部分研究结果显示:将c Tn IAAb与心肌细胞共培养12h后,出现了自噬相关基因Atg5和Beclin-1 m RNA表达显著上调,自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达亦增高,而在24h后这些基因和蛋白的表达都显著下调。心肌细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达则在与c Tn IAAb共培养24h后开始出现变化,48h则更为明显;随共培养时间增加促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达则逐渐减少。整个过程中,心肌细胞出现自噬和凋亡此消彼长的平衡关系;同批实验、相同剂量的c Tn Tp Ab对照和人Ig G对照则无这些变化。但是在本部分实验中并没有观察到c Tn IAAb与原代大鼠乳鼠心肌细胞共孵育后致使心肌细胞出现肥大改变。从这些实验结果得到提示:加入c Tn IAAb对于培养的原代心肌细胞是一种有害的刺激因素,心肌细胞首先表现出与自噬激活相关的基因m RNA和这些基因编码的蛋白质表达上调,自噬激活进行自我保护;当有害刺激因素持续存在的情况下,自噬的激活逐渐减弱,细胞的凋亡开始增加,但是并未出现代偿性心肌细胞肥大或肥大的趋势。完成本部分研究后,我们获得了一部分的实验结果,但是又有不少未解的问题浮现出来。首先,假设c Tn IAAb与心肌细胞膜表达的某个蛋白结合,该蛋白是什么?是c Tn I吗?其次,c Tn IAAb引起心肌细胞自噬和凋亡激活的主要抗原位点是什么?这些均成为我们下一步要研究的重点。第四部分研究目标为克服从患者血清中获得的人c Tn IAAb量有限的困难,选择一株能替代c Tn IAAb的c Tn Im Ab完成后续研究。明确实验室自制的3株c Tn Im Ab(c Tn Im Ab N1,c Tn Im Ab N2,c Tn Im Ab N3)所针对c Tn I的抗原位点位于何部位,其针对的抗原位点是否为人c Tn IAAb所针对的主要c Tn I抗原位点之一,能否与心肌细胞膜呈现结合,以及结合的细胞膜靶抗原是什么。本部分研究结果显示:采用抗原位点竞争结合的方法,发现c Tn Im Ab N1可以与c Tn IAAb竞争结合BCG823和原代乳鼠心肌细胞膜,致使c Tn IAAb与心肌细胞膜的结合率显著下降,并首次证实c Tn IAAb针对的抗原位点主要为c Tn I N端a.a.r.26-49,是c Tn IAAb针对的抗原位点中最主要的、且比例高的之一;采用c Tn Im Ab N1耦联的亲和层析柱纯化出异常表达在BCG823细胞中与之结合的蛋白分子,并通过飞行质谱技术、免疫共沉淀和Western Blotting技术等,首次明确证实该蛋白分子为α-enolase(ENO1),而不是c Tn I,且c Tn Im Ab N1可以与天然状态的α-enolase发生特异性结合。在下一部分实验中我们将采用c Tn Im Ab N1替代c Tn IAAb,明确c Tn Im Ab N1与原代乳鼠心肌细胞膜表达的ENO1结合后,心肌细胞发生了哪些生物学性状改变?本研究使用c Tn IAAb获得的研究结果能否在使用c Tn Im Ab N1后得以重现?心肌细胞发生的生物学性状改变是否在抑制ENO1表达后得以恢复?等等这些科学问题都需要更多的实验室证据给予证实。第五部分研究目标为明确c Tn Im Ab N1能否重现c Tn IAAb致心肌细胞病理变化作用?既然c Tn Im Ab可以识别心肌细胞膜表达的ENO1,c Tn Im Ab与心肌细胞共培养后,ENO1的表达发生了什么变化?这些变化是否与心肌细胞的病理改变相关?本部分研究结果显示:我们成功地将c Tn Im Ab N1替代了从AMI患者血清中提取的c Tn IAAb,在原代大鼠乳鼠心肌细胞诱导出浓度依赖的和时间依赖的凋亡应答。同时,在c Tn Im Ab N1刺激心肌细胞的过程中,ENO1的表达明显升高;采用ENO1-si-RNA抑制ENO1表达后,可以抵抗c Tn Im Ab N1刺激诱导的心肌细胞凋亡;而等浓度的小鼠Ig G对照、c Tn Tm Ab 4T19抗体对照及Negative-si RNA对照均无此现象。本部分研究结果提示我们,AMI血清中的c Tn IAAb与心肌细胞作用所引起的心肌细胞凋亡损害,不仅与c Tn IAAb中与心肌细胞膜结合的抗原位点是否占优势地位有关,也与c Tn IAAb在患者循环中的浓度和持续的时间有关。这些实验现象和结果也许可以解释,为什么在动物模型研究中c Tn IAAb对心脏功能损害作用的因果关系相对比较明确,而在临床研究中,c Tn IAAb在扩张性心肌病、缺血性心肌病等心脏疾病患者预后间的关系中却一直存在争议。既然c Tn Im Ab N1在体外实验中成功地重现了c Tn IAAb在原代乳鼠心肌细胞中诱导凋亡的生物学效应,并明确该作用是通过上调ENO1的表达实现的,那么,c Tn Im Ab N1可否在实验动物中诱导出心脏的损害?该损害是表现为心肌的炎性浸润?还是与体外实验相似的以心肌细胞凋亡为主的病理改变?这些病理改变与ENO1的表达有何关系?什么信号通路介导了这些病理变化?等等这些科学问题,均需要进一步的实验室证据加以证实。第六部分研究目标为使用c Tn Im Ab N1替代c Tn IAAb,尝试在动物体内引起心脏功能障碍和心肌组织的病理改变,并研究其相关的信号通路,旨在能够较确切地阐明c Tn IAAb或c Tn Im Ab N1致心肌损伤的作用和机制,以解释临床中所发现的部分c Tn IAAb阳性患者出现不良临床转归的可能原因,希望本部分的研究结果能丰富自身免疫性心脏疾病免疫病理损伤的发生机制,有助于寻找预防和治疗AMI后心室重构的新靶标和新策略。本部分结果显示:采用c Tn Im Ab N1可成功诱导Balb/c小鼠心脏收缩功能障碍,HE染色、masson染色和Tunel染色结果显示,小鼠心肌组织心肌胶原沉积增加、心外膜钙化斑块形成和心肌细胞凋亡轻度增加,而心脏外形和心肌组织细胞大小未见增加,这些实验结果与第三部分实验中c Tn IAAb作用的原代乳鼠心肌细胞出现凋亡增加,而未出现心肌细胞肥大的研究结果互相印证;采用CD3、CD8、CD4、CD20、CD68对模型小鼠心肌组织进行免疫组织化学染色,未见这些免疫分子表达,表明注射c Tn Im Ab N1的I组小鼠心脏出现的功能和病理改变主要是代偿性的,而非炎性的;采用Path Scan Akt Signaling Antibody Array蛋白芯片对小鼠心肌组织Akt通路16个主要磷酸化蛋白位点进行筛查,发现注射c Tn Im Ab N1的I组小鼠心脏组织出现了第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)Ser380上调和蛋白激酶B(protein kinases B,Akt)Thr308下调,而既有文献证实PTEN缺失与心肌细胞肥大相关,这与前期心肌细胞肥大阴性的结果相互印证;当用c Tn Im Ab N1与原代心肌细胞共培养后,也出现了同样的信号分子改变,在原代心肌细胞中采用si-RNA沉默心肌细胞内的ENO1后,PTEN-Akt信号通路激活的现象减弱,与前期沉默心肌细胞ENO1后心肌细胞凋亡现象得到缓解相互呼应。总之,通过这六部分的实验结果,我们首次明确证实,c Tn IAAb不仅是AMI患者发生心肌损伤后心室重构的独立危险因素之一,而且从发生左室重构的c Tn IAAb阳性AMI患者血清中纯化得到的c Tn IAAb中,针对c Tn I的N端a.a.r.26-49位的c Tn Im Ab N1是其主要组成部分。该c Tn Im Ab N1可以通过与心肌细胞膜的α-enolase发生交叉反应而结合在心肌细胞膜上,引起心肌细胞α-enolase表达升高、PTEN-Akt信号通路激活,PTEN Ser380磷酸化增强,Akt Thr308位磷酸化减弱,最后引起的心肌细胞的改变并不是细胞肥大,而是导致了心肌细胞出现时间依赖性和浓度依赖性的凋亡增加;当采用si-RNA技术沉默心肌细胞的α-enolase,可以纠正PTEN-Akt信号通路激活和改善心肌细胞凋亡现象。接受c Tn Im Ab N1(a.a.r.26-49)注射的Balb/c小鼠模型会发生心肌组织α-enolase表达增加、非炎性代偿性胶原沉积增加、心外膜钙化斑块形成和心脏收缩功能障碍。本研究结果是对自身免疫性心脏病发病机理的重要补充,同时也给临床干预治疗自身免疫性心脏病和改善心肌损伤后自身免疫损伤提供了思路。本课题研究所采用的患者血清、组织均为临床工作的废弃物,得到长海医院医学伦理委员会和解放军第94医院医学伦理委员会研究批准;所采用的实验动物得到第二军医大学实验动物伦理委员会研究批准。