木质纤维素生物质可被纤维素酶降解,降解产生的可发酵糖经进一步转化后可在一定程度上替代利用化石原料生产的燃料及化学品。目前,纤维素酶使用成本较高,限制了木质纤维素的广泛利用。因此,提高纤维素酶产量、降低纤维素酶生产成本具有重大的应用价值和现实意义。丝状真菌纤维素酶基因的表达主要在转录水平受到调控。已有研究表明,多个转录调控因子(ClrB、XlnR等正调控因子,以及CreA、ACEI等负调控因子)共同参与其中。构建转录激活因子ClrB的持续激活突变体以解除纤维素酶基因转录对纤维素的依赖性,以及通过分子改造的方式将CreA的转录阻遏作用转换为转录激活作用,均有助于提高纤维素酶的合成水平。本论文基于草酸青霉中两个关键的纤维素酶转录调控因子ClrB和CreA,构建了能够促进纤维素酶基因转录的人工嵌合转录因子,并结合其它改造靶点开展了菌株的组合遗传改造工作。本论文的主要研究内容和结果如下:1.基于ClrB DNA结合域的纤维素酶嵌合转录激活因子构建及功能分析转录因子ClrB对草酸青霉木质纤维素降解酶的表达具有激活作用,其激活活性需要纤维素的诱导。将ClrB的DNA结合域分别与草酸青霉中受淀粉诱导的淀粉酶转录激活因子AmyR、受木聚糖诱导的木聚糖酶转录激活因子XlnR及其持续激活突变体XlnRA871V的非DNA结合域的序列组装,构建了嵌合因子CA、CX和CXC。将ClrB的DNA结合域与酿酒酵母转录激活因子Ga14的转录激活域组装,构建了嵌合因子CG。将ClrB的DNA结合域、XlnRA871V的非DNA结合域和疱疹病毒来源的转录激活域变体VP64串联组装,构建了嵌合因子CXCV。此外,使用bgl2的启动子启动嵌合因子CXC编码基因的表达,构建了理论上具有正反馈属性的基因表达盒bCXc。将以上嵌合因子基因表达盒转化草酸青霉菌株得到了重组菌株,对不同培养条件下的纤维素酶合成水平进行了测定,发现使用PgpdA启动CXC编码基因表达的策略对诱导型培养基上纤维素酶活力提高的效果最佳。在葡萄糖为碳源的阻遏性条件下,各菌株均不具备明显的纤维素酶合成能力。2.碳分解代谢物阻遏因子CreA功能结构域的改造CreA是草酸青霉中抑制纤维素酶等基因表达的关键阻遏蛋白。本论文设计了CreA的DNA结合域与ClrB的转录激活域嵌合的转录因子,命名为CrCl。理论上,CrCl能够与纤维素酶基因启动子结合,但其转录抑制活性将转变为转录激活活性。使用CrCl的编码基因替换creA基因,得到了菌株CrCl-△creA。该菌株在葡萄糖培养基上的纤维素酶合成水平高于creA敲除菌株△creA,纤维二糖水解酶基因的转录水平也高于△creA。在麸皮、纤维素为碳源的诱导条件下,CrCl-△creA菌株的纤维素酶产量可达到出发菌株的1.75倍,但低于creA敲除菌株。3.纤维素酶系合成调控因子及酶组分编码基因的组合遗传改造在对嵌合转录因子的功能进行分析的基础上,对草酸青霉中其它纤维素酶转录调控相关基因以及纤维素酶基因进行了组合遗传改造,以进一步提高纤维素酶产量并优化纤维素酶系的组成。首先,选取纤维素酶活提高效果最佳的M12-gCXc菌株,敲除对纤维素酶合成具有负调控作用的胞内β-葡萄糖苷酶编码基因bgl2,同时表达来源于黑曲霉的胞外β-葡萄糖苷酶基因Anbgl1,得到gCXc-bB菌株。在麸皮、纤维素条件下进行发酵培养,发现其β-葡萄糖苷酶活力比M12-gCXc提高了495倍。进一步在敲除碳降解物阻遏因子CreA编码基因的同时表达来源于里氏木霉的纤维二糖水解酶编码基因Trcbh1,得到gCXc-bB-cC菌株。在麸皮、纤维素条件下进行发酵培养,该菌株的滤纸酶活力较M12-gCXc提高了3.2倍,达到14.4U/ml,纤维二糖水解酶活力在96h时较M12-gCXc提高了 7.7倍。