【摘 要】
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目的目前关于KLF6去泛素化过程的研究较少,本课题旨在筛选出KLF6的去泛素化酶,探索去泛素化酶USP26调控KLF6的分子机制以及对宫颈癌细胞生物学功能的影响。方法1、在Hela、MCF-7、Huh7等细胞系中加入MG132处理6h,Western blot检测KLF6蛋白水平的变化,挑选出KLF6蛋白水平升高的细胞系作为目的细胞系。2、将已构建的约96个去泛素化酶质粒转染进293T、Hela细
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目的目前关于KLF6去泛素化过程的研究较少,本课题旨在筛选出KLF6的去泛素化酶,探索去泛素化酶USP26调控KLF6的分子机制以及对宫颈癌细胞生物学功能的影响。方法1、在Hela、MCF-7、Huh7等细胞系中加入MG132处理6h,Western blot检测KLF6蛋白水平的变化,挑选出KLF6蛋白水平升高的细胞系作为目的细胞系。2、将已构建的约96个去泛素化酶质粒转染进293T、Hela细胞中,检测KLF6蛋白水平变化。3、过表达及敲低USP26,检测细胞中KLF6的蛋白水平变化。4、USP26和KLF6共转进细胞,在不同时间点施加蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理,收集细胞后检测KLF6蛋白水平变化,判断USP26是否能够影响KLF6蛋白的衰减速度。5、用免疫共沉淀的方法检测USP26和KLF6间的相互作用情况,并且确定USP26与KLF6的相互作用区域。6、泛素化实验探究USP26去泛素化KLF6的情况。7、用克隆形成实验、CCK-8法、划痕实验测定细胞的增殖、迁移能力,分析USP26对宫颈癌细胞的生物学行为的影响。结果1、通过对已有去泛素化酶库的筛选,找到KLF6的去泛素化酶USP26。2、在293T、Hela细胞系中转染了USP26后,稳定了KLF6的蛋白表达水平;敲低USP26后,KLF6蛋白表达水平降低。半衰期实验证明,USP26能够延缓KLF6蛋白的衰减速度。3、免疫共沉淀实验表明USP26和KLF6间存在相互作用,并且发现USP26285-913结构域与KLF6发生相互作用,而非USP26 1-295结构域。4、野生型USP26能够减少KLF6的泛素化水平,而USP26酶活突变体（USP26C304S）则失去了去泛素化能力。5、生物学实验表明,过表达USP26抑制了Hela细胞的增殖和迁移,敲低USP26可以促进Hela细胞的增殖迁移。结论去泛素化酶USP26能够去泛素化KLF6,调节KLF6的稳定性,并与宫颈癌细胞的增殖、迁移具有密切的相关性。
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