【摘 要】
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泛素化是真核细胞中普遍存在的蛋白质翻译后修饰现象,具有介导蛋白质降解、定位、激活等多种功能。泛素化过程由一系列酶催化,E3泛素连接酶是直接介导泛素向底物蛋白转移的酶,在泛素化的特异性方面发挥重要作用。人类存在600多种E3,调控成百上千种底物蛋白的泛素化,参与广泛的生命活动。HECT型、RING型和RBR型是泛素连接酶E3的三大类型,其中RING型E3研究最多,对其机制的了解也最为深入,而RBR型
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泛素化是真核细胞中普遍存在的蛋白质翻译后修饰现象,具有介导蛋白质降解、定位、激活等多种功能。泛素化过程由一系列酶催化,E3泛素连接酶是直接介导泛素向底物蛋白转移的酶,在泛素化的特异性方面发挥重要作用。人类存在600多种E3,调控成百上千种底物蛋白的泛素化,参与广泛的生命活动。HECT型、RING型和RBR型是泛素连接酶E3的三大类型,其中RING型E3研究最多,对其机制的了解也最为深入,而RBR型E3则是最晚发现且了解最少的。RBR型E3中具有Ariadne特征结构域的成员组成了Ariadne RBR E3亚家族。Human homolog of Drosophila Ariadne-1（ARIH1）是果蝇中ariadne-1的人类同源蛋白,属于Ariadne RBR E3类。在本文之前,已有研究表明:1)ARIH1单独存在时,其具有催化活性的位点由于被Ariadne结构域掩埋导致无法执行泛素转移功能,因此处于自抑制状态;2)当ARIH1与经过类泛素蛋白NEDD8修饰的Cullin-RING E3 ligases（CRLs）结合时,其自抑制状态解除,E3酶活性被激发。然而,激活态结构和激活分子机制尚未可知。本课题对NEDD8-CRL-ARIH1-Ubch7-Ub蛋白复合体的结构生物学研究进行了初步的探索:1)我们通过构建不同的重组质粒,分别探索了在原核/真核表达系统中以及单独表达/共表达方式下的蛋白表达情况,最终选用了更为高效的原核、单独表达纯化方式获得组分蛋白;2)在此基础之上,通过筛选纯化标签和优化纯化步骤,我们得到了纯度与产量均符合基本要求的蛋白样品;3)分别验证了CUL1、2、3、4A均具有体外类泛素化活性;4)通过分子筛成功验证了CRLs与ARIH1间具有强相互作用,并且通过蛋白截短验证了CRLs的CTD与ARIH1互作至关重要;5)体外验证了复合体具有自泛素化活性,同时也对蛋白复合体样品进行了进一步的晶体学筛选,遗憾的是,由于复合体组分众多且较为动态,结晶难度大,一直未筛选到合适的可结晶条件。本研究虽然未能得到NEDD8-CRL-ARIH1-Ubch7-Ub蛋白复合体的晶体,但对该蛋白复合体的样品制备方式进行了优化,为后续开展复合体动态结构表征研究提供了一定的基础。
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