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第一部分 RANK通过激活内质网应激促进2型糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究研究背景糖尿病肾病是临床常见又棘手的肾病,足细胞损伤在糖尿病肾病的进展中起着核心作用,内质网应激是糖尿病肾病足细胞损伤的关键环节。NF-κB受体活化因子(Receptor Activator of NF-κB,RANK)属于肿瘤坏死因子受体超家族。本课题组之前的研究已经证明RANK通过促进氧化应激介导1型糖尿病肾病足细胞损伤,但是这种作用不完全,是否有别的通路也与之有关,目前尚不清楚。2型糖尿病肾病与1型糖尿病肾病从发病机制到病理表现都不一样,RANK是否在2型糖尿病足细胞损伤中起同样作用,目前尚不清楚。本实验在2型糖尿病肾病患者中证实RANK的表达较正常人增加。建立2型糖尿肾病足细胞特异性过表达及敲除RANK小鼠模型,建立体外糖尿病肾病足细胞模型,探索RANK是否通过内质网应激介导2型糖尿病肾病足细胞损伤。目的探讨RANK在2型糖尿病足细胞损伤中的作用,及其与内质网应激的关系。方法1.免疫组化检测2型糖尿病肾病患者及正常组织RANK的表达。2.建立足细胞特异性过表达和敲除RANK db/db模型鼠。3.PCR检测模型鼠基因表达并分组。4.RNAscope和免疫荧光检测各模型鼠足细胞RANK的表达。5.检测各组小鼠体重、血糖、蛋白/肌酐、血肌酐。6.PAS染色及电镜观察各组病理。7.免疫组化检测各模型鼠足细胞GRP78、P-PERK的表达。8.体外建立RANK过表达及敲除足细胞模型,并验证转染效率。9.WB检测足细胞中GRP78、P-PERK、ATF4、P-eIF2α、Podocin的表达。10.划痕实验验证RANK对足细胞迁移的影响,内质网应激促进RANK对足细胞的迁移。结果免疫组化证实2型糖尿病肾病患者肾穿刺活检标本中RANK表达较正常对照组增加。小鼠剪尾PCR检测模型鼠基因,RNAscope及免疫荧光检测各组小鼠足细胞RANKmRNA及蛋白表达情况。小鼠过表达RANK后蛋白/肌酐比值更高,血肌酐更高,PAS检测肾小球系膜基质明显增加,电镜观察肾小球基底膜明显增厚,免疫组化检测GRP78、P-PERK蛋白表达明显更高。而小鼠敲除RANK后这些变化都得到明显改善。WB示高糖体外刺激足细胞后RANK表达增加,分别对足细胞过表达和敲除RANK进行效率验证。WB示体外培养的足细胞RANK的表达与内质网应激相关蛋白的表达呈正相关,与Podocin的表达呈负相关。划痕实验可见RANK过表达时足细胞迁移增加,RANK敲除时足细胞迁移减少。内质网应激抑制剂可抑制RANK对足细胞迁移的增加。结论2型糖尿病肾病患者RANK表达较正常人增加。足细胞特异性过表达RANK的2型糖尿病肾病模型鼠肾损伤加重,RANK敲除鼠肾损伤减轻。GRP78和P-PERK与RANK表达正相关。体外培养的足细胞证实RANK可以通过内质网应激刺激足细胞迁移,最后加重2型糖尿病肾病损伤。第二部分 PPBP参与2型糖尿病肾病足细胞损伤的生物信息学分析研究背景糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是一种与糖尿病相关的肾脏损伤疾病,其发病率呈显著上升趋势。然而,目前在糖尿病肾病的治疗和预后方面仍存在许多难点,寻找新的2型糖尿病肾病足细胞损伤的影响因子将有助于降低糖尿病肾病的发病率,并开发新的预防方法。目的用生物信息学方法寻找2型糖尿病肾病足细胞损伤的影响因子,并验证。方法1.从含糖尿病肾病肾小球样本的数据集GSE36336中筛选出了238个差异表达基因。2.通过富集分析了解差异表达基因的生物学功能。3.根据蛋白-蛋白相互作用网络,筛选糖尿病肾病中的前10个候选枢纽基因。4.在Nephroseq v5中,利用外部数据集检验中枢基因表达情况与糖尿病肾病临床特征之间的相关性。5.对体外培养的足细胞糖尿病肾病模型进行转录组测序。6.用实时定量PCR、肾脏组织学分析、免疫荧光等实验来验证血小板前碱性蛋白(pro-platelet basic protein,PPBP)参与2糖尿病肾病足细胞损伤。结果从GEO下载数据集GSE36336,经过差异表达分析,共筛选出238个差异表达基因,其中153个的表达量发生上调,85个的表达量发生下调。热图的形式呈现差异度前30名的差异表达基因及其表达量。对差异表达分析进行GO,KEGG与MeSH富集分析。根据蛋白-蛋白相互作用网络,筛选糖尿病肾病中的前10个候选枢纽基因(Serpine1,Cxcl10,Cfd,PPBP,Retn,Socs2,Ccr5,Mmp8,Pf4,Cxcl9),并初步确定PPBP作为中枢基因。在Nephroseq v5的Hodgin Diabetes Mouse Glom数据集中,Ccr5、Cfd、Cxcl10、Pf4、PPBP和Serpine1在糖尿病肾病与正常样本间的表达量存在显著差异。对高糖刺激的足细胞进行转录组测序,再次验证PPBP作为中枢基因的可靠性。db/db鼠与对照鼠相比,体重明显增加,血糖水平明显增加,血清肌酐明显升高,尿蛋白/肌酐显著增加。对于组织病理学检查,PAS染色可见db/db鼠肾小于系膜细胞明显增生。在高糖刺激的足细胞中,PPBP mRNA的表达增加。在免疫组织化学实验中,与正常对照组相比,db/db小鼠肾小球中PPBP的表达显著升高。在免疫荧光分析中,与正常对照组相比,PPBP在db/db小鼠肾脏足细胞中的表达增加。结论PPBP参与2型糖尿病肾病足细胞损伤。