气管支架置入后引起支架内狭窄是临床上较棘手的问题,目前针对支架内肉芽组织生长的治疗主要有内镜下介入治疗及药物治疗,内镜下介入治疗包括冷冻、激光、高频电凝等治疗[1],但反复多次介入治疗,费用高,增加患者经济及心理负担。药物治疗主要包括全身治疗及局部治疗,研究发现全身应用地塞米松、免疫抑制剂可抑制气管内肉芽组织生长[2][3],但全身应用药物副作用相对较大。局部用药可使药物特异性直接作用于靶病灶,避免了对全身其他器官的影响。结合目前研究发现,吸入布地奈德或局部应用丝裂霉素C、紫杉醇均可有效抑制肉芽组织生长[4]～[7],但局部应用药物作用时间较短暂,不能持续抑制肉芽组织生长。近年来,随着药物洗脱支架的问世,使得这一难题得到很好的解决,药物可以通过与多聚物结合形成混合液,通过混合液涂层支架而达到药物持续释放的目的。目前国内外学者已制备丝裂霉素C、顺铂、地塞米松洗脱支架并成功用于动物模型,发现药物持续释放时间可达1月以上,并有抑制局部炎症反应及肉芽组织增生的作用[8]～[10]。肉芽组织生长有很多机制,包括局部受压、炎症、血管上皮因子过度表达等,其中免疫抑制剂抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路,进一步可抑制肉芽肿生长。西罗莫司属于大环内酯类抗生素,同时也是一种免疫抑制剂,具有抗炎、抗增殖、抗排斥的作用[11]。动物实验表明,西罗莫司可抑制mTOR通路,抑制局部炎症级联反应,从而抑制肉芽组织生长并能修复损伤愈合[12][13]。临床研究发现在肺移植后气管狭窄需置入气管支架的患者中全身应用西罗莫司有抑制气管支架内肉芽组织生长的作用[2]。国内有学者对先天性气管狭窄患儿置入雷帕霉素涂层支架,发现其可有效减轻气道阻塞症状[14],故西罗莫司对肉芽组织生长可能有潜在的抑制作用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为控制药物释放的平台具有良好的生物相容性,不会引起明显免疫反应和细胞毒性反应,这类材料常被用来控制药物释放,药物释放完后只留裸金属支架在原位,完全可代谢为水和二氧化碳。研究发现PLGA与西罗莫司结合时不会发生相互作用[15],是作为载药材料的首选。对于支架材质的选择,目前临床上较常用的为金属支架,金属支架适用于较小的管腔,可随着婴幼儿生长而扩张,且置入操作相对较简单[16]。而金属合金支架在增加径向强度及提高辐射不透性等方面均优于裸金属支架,且其生物惰性更强[17][18],其中镍钛记忆合金支架具有良好的动态扩张性,不易变形,支撑力强、耐腐蚀,不影响痰液引流[19]。制备药物洗脱支架的相对简便方法有两种:浸涂法和喷涂法,国内第三军医大学陈勇鹏等人通过制备地塞米松洗脱支架对两种方法进行比较,发现浸涂的载药量明显高于喷涂,且喷涂易造成支架药物分布不均匀[20],故浸涂法更适合用于药物支架制备的研究。对于实验动物的选择,目前常用的有猪、狗、猴、兔等,其中狗、猪气管腔较宽大,其气管与人相差不大,是成年人气道疾病模型的理想动物,但费用相对昂贵,且不易控制及搬运固定,限制其在实验研究中的应用。猴与人类的生理解剖方面有很多的相似性,但由于价格昂贵、饲养困难及实验难度大等原因,研究甚少。而兔子价格低廉,容易饲养,操作容易和安全。研究发现4岁儿童气管大体形态与4月龄兔气管大小相似[21],故可用成年兔模拟儿童气管。新西兰白兔环状软骨下方的气管前后径约5.81mm,左右径为5.41mm[22],声门至气管隆突的距离为7～8.5cm[23],根据支架直径应为气管直径的1.2～1.3倍原则,选用气管支架直径为6mm,长度为30mm较为合适。本研究以镍钛合金支架为平台,用PLGA为载药材料,利用浸涂法制备含有西罗莫.司的气管药物支架,置入实验组兔气管内,同时将裸金属支架置入对照组实验兔气管,同期对比观察缓慢释放的药物对气管支架内狭窄的作用,为药物洗脱气管支架在临床上应用提供实验室参考依据。目的1.利用浸涂法制备西罗莫司洗脱支架,并检测支架所含药物浓度及药物涂层分布情况。2.通过气管切开法直视下置入药物洗脱支架,探索药物洗脱支架在动物模型上应用的安全性。3.通过分别将药物支架或裸支架置入动物模型气管内,明确药物支架对支架内肉芽组织增生及炎症反应的作用。研究方法实验一西罗莫司洗脱支架制备:根据相关文献对裸金属支架进行清洗[24],结合本实验前期研究的结果,发现西罗莫司与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)剂量在0.04:0.4(g)比例时体外释放时间最长,可达1月以上。从而确定西罗莫司与PLGA的剂量,配制其混合溶液,通过浸涂法制备药物洗脱支架。利用扫描电镜(SEM)判断药物涂层厚度及明确药物涂层在支架的分布情况,使用高效液相分析法(HPLC)检测支架所含药物的浓度。实验二西罗莫司洗脱支架在动物模型上应用的安全性及有效性研究:将16只成年新西兰白兔随机分为实验组(n=8)和对照组(n=8),实验组横向切开兔气管,置入自制西罗莫司洗脱支架后闭合气管。对照组同等条件下置入裸金属支架。分别于术后第2、4周使用超细气管镜观察气管支架内肉芽组织生长情况,并根据肉芽组织阻塞气道的程度估算气管狭窄程度,轻度为气道阻塞小于25%,中度为25%～50%,重度为50%～75%,极重度为75%～100%。术后第4周处死所有动物,取气管大体标本,HE染色后进行组织学观察。结果1.西罗莫司洗脱支架制备:应用超声及有机溶剂法清洗支架,可将支架表明杂质去除,并且扫描电镜下未见支架损坏等现象。利用浸涂法可制备西罗莫司洗脱气管支架,支架涂层厚度约4～5μm,扫描电镜下观察可见药物较均匀分布在支架表面。药物支架经有机溶剂洗脱,用HPLC法检测有机溶剂中西罗莫司浓度,测得药物支架含西罗莫司平均浓度为80.5μg。2.西罗莫司洗脱支架对于支架内肉芽组织增生作用研究结果:本研究实验过程中实验组及对照组各有1只动物死亡,余实验动物均存活至实验终点,且均出现不同程度的气管狭窄。超细气管镜观察显示,术后2周,对照组动物气管内支架区轻度肉芽组织生长,部分动物可见大量黏液潴留。实验组未见明显肉芽组织生长,部分动物可见较多黏液潴留。术后4周,对照组动物气管内支架区出现轻.至中度肉芽组织增生,个例出现气管严重堵塞,肉芽组织增生部位尤以支架上缘及下.缘为著,气管切开处未见狭窄。实验组动物气管内支架区轻度肉芽组织增生,增生部位主要位于支架上缘。实验过程中未发现支架移位、断裂等现象。取支架内肉芽组织增生部位及气管切开缝合处的气管大体标本进行组织学观察,利用Image J软件分别测两组400倍视野下肉芽组织厚度。随机选取5个400倍视野,根据炎症细胞浸润程度将炎症反应分为5级,0级为无炎症,1、2、3、4级分别为炎症细胞浸润<10%区域、10～30%、30～60%、弥漫的超过600%的区域[25]。将数据进行统计分析,结果表明实验组(1577.529±507.971)肉芽组织厚度(μm)小于对照组(812.945±235.893)(t=3.612,P=0.004),实验组(平均秩次4.93)炎症反应程度轻于对照组(平均秩次10.07)(Mann-Whitney U=6.500,P=0.014),且炎症反应越强,肉芽组织增生越明显(相关系数r=0.809,P=0.000)。而气管切开处HE染色可见轻度炎症反应,未见纤维肉芽组织增生。结论1.浸涂法操作简单,可使药物均一分布在支架表面。本实验利用浸涂法成功制备满足实验所需的药物支架,药物涂层在支架表面紧密附着且分布较均一。2.本实验自制的药物支架在动物模型上证实是一个安全有效的新型气管药物洗脱支架,有潜在的临床应用价值,为改进支架设计提供实验室依据。4.与裸金属支架相比,西罗莫司气管药物支架可以有效抑制支架内肉芽组织形成,减轻局部炎症反应。5.位于支架覆盖区域的气管组织炎症反应程度越强,肉芽组织增生越明显,二者存在高度正相关作用。6.气管切开缝合区域未见肉芽组织增生及狭窄,可见轻度炎症反应。