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目的:目前全世界约有5000万人罹患癫痫,临床以药物对症治疗为主,但仍有约30%患者的发作未得到有效控制,其中相当一部分发展为难治性癫痫,深入探究其发生机制并寻找新的治疗手段是亟待解决的临床问题。越来越多的研究发现,癫痫发作易感性增加及癫痫形成与神经炎症密切相关,作为炎性复合体的NLRC4炎症小体在神经系统疾病发病机制中的作用正日益受到关注。本研究应用海人酸(kainic acid,KA)诱导的小鼠癫痫持续状态(status epilepticus,SE)模型,探讨NLRC4炎症小体介导的神经炎症对SE发作及SE后海马损伤的影响,为形成对SE后颞叶癫痫以免疫调节干预神经炎症为核心的治疗新策略提供理论和实验依据。方法:第一部分NLRC4及其下游信号分子在SE小鼠海马组织中的表达1.KA诱导的小鼠SE模型的建立:取95只8周龄的健康雄性C57BL/6小鼠,首先随机分为两组:建模组(n=80)和空白对照CON组(n=15)。建模组小鼠依据体重经腹腔注射相应剂量的KA(20 mg/kg)诱导小鼠SE模型。建模后观察小鼠发作症状,并依照Racine评分标准将造模成功的小鼠按时间点SE 3 h、SE 6 h、SE 12 h和SE 24 h随机分配到各亚组中。CON组小鼠在相同时间点腹腔注射等量的生理盐水(normal saline,NS)。2.NLRC4、cleaved-caspase-1 和 cleaved-IL-1β 在 SE 小鼠海马组织中的表达:用免疫印迹法检测SE后小鼠海马组织中NLRC4、cleaved-caspase-1和cleaved-IL-1β蛋白的表达水平;用免疫荧光法观察SE后小鼠海马组织中NLRC4的表达变化。3.NLRC4在SE小鼠海马组织中的细胞定位:用免疫荧光双标法观察NLRC4分别与星型胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、小胶质细胞标记物离子钙结合衔接分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,IBA1)和神经元标记物微管相关蛋白2(microtubule associatedprotein2,MAP2)的共表达。第二部分沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE发作及SE后海马损伤的影响1.检测以慢病毒为载体的短发卡RNA(LV-NLRC4-RNAi)对NLRC4表达的干扰效率:用立体定位技术向小鼠海马内注射LV-NLRC4-RNAi或阴性对照慢病毒(LV-CON)。注射后14d用免疫荧光法观察慢病毒是否成功感染小鼠海马体;用免疫印迹法检测LV-NLRC4-RNAi在小鼠海马内的抑制效率。2.沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE发作症状的影响:取72只6周龄的健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为四组(每组n=18),海马内注射LV-NLRC4-RNAi/LV-CON,14d 后腹腔注射 KA/NS:(1)LV-NLRC4-RNAi+SE 组;(2)LV-NLRC4-RNAi+NS组;(3)LV-CON+SE组;(4)LV-CON+NS组。在注射慢病毒后第14 d,制备小鼠SE模型并在此过程中观察小鼠SE发作潜伏期和发作级别的变化。3.沉默海马中NLRC4的表达对SE小鼠海马NLRC4-caspase1-IL-1β轴的影响:用免疫印迹法检测SE后12 h小鼠海马组织中NLRC4、cleaved-caspase-1和cleaved-IL-1β蛋白的表达变化。4沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE后海马神经元丢失的影响:在SE后14d,用尼氏染色法比较各组小鼠海马CA1区和CA3区神经元的数量及形态。5.沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE后海马星型胶质细胞增生的影响:在SE后14 d,用免疫组化法分析各组小鼠海马CA1区、CA3区和齿状回(dentate gyrus,DG)GFAP的表达。结果:第一部分NLRC4及其下游信号分子在SE小鼠海马组织中的表达1.KA诱导的小鼠SE模型的建立:建模组小鼠于腹腔注射KA后,按照Racine评分标准达到4级或以上持续发作的小鼠共73只,诱导成功率为91%(73/80),造模过程中有5只小鼠因全身强直抽搐死亡,故最终可纳入建模组的小鼠共剩余68只,提示本次KA诱导的小鼠SE模型建立成功。将此68只小鼠随机分入各亚组中,即:SE3h 组(17 只)、SE6h 组(17 只)、SE 12 h 组(17 只)、SE 24 h 组(17 只)。CON 组在相同时间经腹腔注射等量的NS后未出现以上发作表现,无小鼠死亡。2.NLRC4、cleaved-caspase-1 和 cleaved-IL-1 β 在 SE 小鼠海马组织中的表达:(1)免疫印迹结果显示,在SE后3h、6h、12h和24h,小鼠海马组织中NLRC4蛋白的表达水平较对照组均明显升高(P<0.05),在SE后12 h达到最高。同时,cleaved-caspase-1和cleaved-IL-1β蛋白在SE后3h、6h、12 h和24h的表达水平也均显著高于对照组(P<0.05),且表现出与NLRC4相同的变化趋势。(2)免疫荧光结果显示,小鼠海马组织中NLRC4的荧光在SE后12 h较对照组显著增强(P<0.05)。3.NLRC4在SE小鼠海马组织中的细胞定位:免疫荧光结果显示,在SE小鼠海马组织中,NLRC4与GFAP和IBA1均存在共表达,其中与GFAP的共表达更明显,未见与MAP2的共表达。第二部分沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE发作及SE后海马损伤的影响1.LV-NLRC4-RNAi对NLRC4表达的干扰效率:小鼠海马内注射慢病毒后第14d实验结果如下(1)免疫荧光显示,小鼠大脑皮层及海马CA1区、CA3区和DG均有绿色荧光分布,其中海马以CA1区和DG区最为明显,表明海马内立体定位注射LV-NLRC4-RNAi成功感染小鼠海马体。(2)免疫印迹显示,LV-NLRC4-RNAi组海马组织中NLRC4蛋白的表达水平较LV-CON组显著降低(P<0.05),表明海马内立体定位注射LV-NLRC4-RNAi有效抑制了海马组织中NLRC4蛋白的表达。2.沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE发作症状的影响:(1)小鼠于腹腔注射KA后,按照Racine评分标准,LV-NLRC4-RNAi+SE组有3只未达到持续4级或以上发作,另有1只在造模过程中因全身强直抽搐死亡,均剔除出组,该组最终剩余14只小鼠。LV-CON+SE组有3只未达到持续4级或以上发作,有2只在造模过程中死亡,均予排除出组,该组最终剩余13只小鼠。对照组(LV-NLRC4-RNAi+NS组和LV-CON+NS组)在相同时间经腹腔注射等量的NS后未出现以上发作表现,两组最终均剩余18只小鼠。(2)LV-NLRC4-RNAi+SE组小鼠的发作潜伏期为42.64±7.32 min,而LV-CON+SE组为35.77±4.21 min,前者明显延长(P<0.05),提示沉默海马中NLRC4的表达降低了 KA诱导小鼠SE发作的易感性。(3)按照Racine评分标准,LV-NLRC4-RNAi+SE组小鼠的发作级别与LV-CON+SE组相比明显降低,其中在腹腔注射KA后第30 min、40 min和50 min的差异具有统计学意义(P<0.05),提示沉默海马中NLRC4的表达减轻了小鼠SE发作的严重程度。3.沉默海马中NLRC4的表达对SE小鼠海马NLRC4-caspasel-IL-1β轴的影响:免疫印迹结果显示,在SE后12 h,LV-NLRC4-RNAi+SE组小鼠海马组织中NLRC4蛋白的表达水平较LV-CON+SE组显著下降(P<0.05),LV-NLRC4-RNAi+SE组cleaved-caspase-1和cleaved-IL-1β蛋白的表达水平均显著低于LV-CON+SE组(P<0.05)。4沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE后海马神经元丢失的影响:尼氏染色结果显示,在SE后14d,LV-CON+SE组小鼠海马CA1区和CA3区的神经元数量均显著低于LV-CON+NS组(P<0.05),且神经元排列紊乱松散;LV-NLRC4-RNAi+SE组小鼠海马CA1区和CA3区的神经元数量较LV-CON+SE组均明显增多(P<0.05),且与LV-NLRC4-RNAi+NS组和LV-CON+NS组无显著差异(P>0.05),结构趋于正常,表明在SE后14 d海马可出现神经元丢失和结构破坏,沉默海马中NLRC4的表达可减轻SE后海马神经元的缺失程度。5.沉默海马中NLRC4的表达对小鼠SE后海马星型胶质细胞增生的影响:免疫组化结果显示,在SE后14 d,LV-CON+SE组小鼠海马CA1区、CA3区和DG区GFAP的表达均显著高于LV-CON+NS组(P<0.05);LV-NLRC4-RNAi+SE组小鼠海马CA1区、CA3区和DG区GFAP的表达较LV-CON+SE组均显著下降(P<0.05),且与LV-NLRC4-RNAi+NS组和LV-CON+NS组无显著差异(P>0.05),表明在SE后14 d海马可出现星形胶质细胞增生,沉默海马中NLRC4的表达可减轻SE后海马星型胶质细胞增生的程度。结论:1.NLRC4炎症小体在KA诱导的SE小鼠海马组织中被激活,且主要在星形胶质细胞中高表达,其活化与SE后海马区的神经炎症反应相关。2.沉默海马中NLRC4的表达可降低KA诱导小鼠SE发作的易感性,减轻SE发作的严重程度,并对SE后的海马损伤具有保护作用。