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背景:缺血性脑卒中是最常见的死亡和致残原因之一,作为严重威胁人们生命安全和生活质量的疾病,该疾病不仅给家庭带来沉重的负担,社会医疗资源也面临严峻的考验。流行病学的调查研究发现该疾病不仅发病率越来越高,而且呈现越来越低龄化的趋势。临床上对于错过溶栓治疗时间窗的该类疾病患者尚无有效精准的治疗策略。因此,深入研究脑卒中发生发展的机制解决临床问题已经成为神经学科亟待解决的重要课题。近年来,随着对该疾病研究的不断深入,miRNA与脑卒中疾病的相关性逐渐被人们认识。在人类基因中,三分之一的基因表达均受到各物种间具有高度保守性miRNA的调控而参与人体重要的生物调节过程如增殖分化,自噬凋亡等。并且,miRNA在脊椎动物中有一半与其他物种还具有同源性。这些特点为挖掘miRNA与疾病之间的关联性提供了基础,而且快速发展的高通量芯片技术为我们在基因组水平研究与疾病相关的分子机制提供了可能性。鉴于此,我们推断(1)鉴于miRNA在细胞内具有广泛的生物学功能,建模的多条miRNAs共同作用在脑卒中损伤级联中必有重要作用,通过研究缺血性脑卒中多条miRNAs的联合功能,开启了研究脑卒中损伤机制的新方式;(2)筛选小鼠脑缺血模型组中半影区与对照组大脑相同部位miRNA的表达谱,借助生物信息学技术进行数据建模并挖掘出脑缺血相关的特异性表达的miRNAs具有可行性;(3)通过构建miRNAs/mRNA共表达网络、基因位点GO分析和KEGG通路分析及双荧光素酶报告实验系统探讨脑组织缺血区差异表达的基因在脑卒中的机制为发现新的治疗靶点奠定理论基础。目的:本研究利用芯片大数据和先进的数据处理分析方法来建立可靠的脑卒中相关的miRNAs(miR-124/miR-216)关联模型,在此基础上利用生物信息学技术进行系统分析并探讨miRNAs联合体和靶基因的功能定位及与脑卒中发生发展的关联意义;同时运用分子生物学、细胞生物学等技术手段在分子水平、细胞水平、动物水平上揭示mi R-216、miR-124与CADM2之间的相互作用及分子机制,并探索两者之间的相互关系在脑卒中发生发展中的调控作用,进一步完善脑卒中发生发展的分子机制,为临床上脑卒中的防治提供新的治疗靶标。方法:1.第一部分下载GEO数据库中脑缺血再灌注损伤小鼠的miRNAs的芯片数据并对数据进行分析整理;运用Weka软件筛选获得的差异表达基因并构建意义miRNAs协同调控脑卒中进展相关的数据模型;应用生物信息软件挖掘miRNAs的靶基因并采用荧光素酶报告实验验证miRNAs与靶基因的关系。2.第二部分体外构建OGD模型;转染miRNAs的激动剂和抑制剂至各实验组并用CCK-8实验、流式细胞分析技术、基质胶成管实验、PCR法及Western blot检测并分析生物学效应。3.第三部分构建小鼠的MCAO模型获取最佳造模时间;构建慢病毒;利用miRNAs的慢病毒处理各实验组同时进行神经功能评分,TTC,Tunel法,PCR法及Western blot法分别检测及分析细胞凋亡率及基因和蛋白表达等相关生物学效应。结果:1.通过基因芯片数据分析处理获得包括miR-216和miR-124在内的30条与小鼠缺血再灌注损伤相关的差异表达miRNAs;通过体外建模挖掘与脑卒中疾病相关的目标miRNAs(miR-124/miR-216)及潜在作用的共同靶基因CADM2,并且进行了潜在的作用通路和功能分析发现目标miRNAs(miR-124/miR-216)调控靶基因CADM2可能影响脑卒中的进展过程。2.采用小鼠N2a细胞行氧糖剥夺(OGD)处理,在此基础上分别转染和共转染外源性miR-216与miR-124的激动剂和抑制剂予各组检测细胞存活率、细胞凋亡率、成管能力以及相关凋亡通路蛋白表达的表达情况。我们发现mi R-216与miR-124的高表达能增加细胞的存活率,抑制细胞凋亡的发生;当共转染miR-216与miR-124的激动剂后能更显著抑制与脑卒中模型细胞关系密切细胞的凋亡。3.成功构建慢病毒后,基于MCAO模型并转染过表达miR-216/miR-124的慢病毒载体,我们发现转染过表达病毒的小鼠神经功能评分较好,凋亡较少,过表达miR-216/124的小鼠靶基因CADM2降低明显,差异有统计学意义。结论:通过公共数据库的数据挖掘和分析获知30条miRNAs与小鼠缺血再灌注损伤相关的差异表达miRNAs。在此基础上用生物软件建模获悉到意义模型miR-124/miR-216协同调控脑卒中的进展过程,其调控的机制可能与共同靶基因CADM2启动凋亡信号通路相关。从细胞实验和动物实验我们进一步论证发现miR-216/miR-124联合体协同参与调控缺血再灌注小鼠的神经细胞功能,其机制为miR-216/miR-124协同负性调控CADM2使其激活PI3K-Akt信号通路,启动了内源性保护机制改善神经细胞的凋亡,从而达到保护神经细胞的作用。在这里,我们首次利用大数据挖掘和建模发现miRNA-216与miRNA-124能作为脑卒中进展相关的分子标志物模型协同调控其病理过程,并揭示了miRNA-216与miRNA-124以及CADM2之间构成的新的调控脑卒中的分子网络。通过三者的相互作用激活PI3K-Akt信号通路进而启动内源性的脑保护作用,miR-216/miR-124/CADM2/PI3K-Akt信号通路的揭示均是本研究的创新。