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诺瓦克样病毒是引起非菌性急性胃肠炎的重要病原之一,国内外由诺瓦克样病毒引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为贝类、蔬菜、沙拉、熟食等。本研究针对食品中（贝类）诺瓦克样病毒RT-PCR检测的特殊性,建立了快速检测贝类中诺瓦克样病毒的RT-PCR方法,消除RT-PCR反应抑制因子,缩短食品中诺瓦克样病毒的检测时间,提高检测方法的灵敏性,为诺瓦克样病毒引起的食源性疾病的快速诊断提供技术支持。 本研究以诺瓦克样病毒的依赖RNA的RNA聚合酶区为靶基因,选择特异性引物,进行RT-PCR扩增,检测贝类中的诺瓦克样病毒。对PCR反应体系中镁离子浓度、引物量、退火温度和循环数进行优化,以确定适宜RT-PCR反应体系和RT-PCR扩增程序,其适宜反应体系为:反转录反应体系:总反应体系为20μL。包括AMV(5u·μL-1)1μL,5×Reverse transcriptase buffer 4μL,RNase Inhibitor(40U·μL-1)0.5μL,dNTPs混合物(10mmol·L-1each)2μL,下游引物(10μmol·L-1)3.5μL,模板4μL,水5μL;PCR反应体系:总反应体系为50μL。包括RT-Mixmre 20μL,10×PCRbuffer 5μL,Taq(5U·μL-1)1μL,dNTPs混合物(2.5mmol·L-1each)5μL,上游引物(10μmol·L-1)2μL,Mg2+(25mmol·L-1)7μL,水10μL。其适宜RT-PCR扩增程序为:反转录过程为42℃,1h;PCR反应过程为,94℃预变性3min;变性94℃ 0.5min,退火46.9℃ 1.5min,延伸72℃ 1.0min,进行40个循环,最后72℃延伸5min。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对RT-PCR扩增产物进行了DNA测序,RT-PCR扩增产物DNA序列与靶基因序列的同源性达99%,从而证实RT-PCR扩增产物确为目的扩增产物。RT-PCR方法的检测灵敏度为79RT-PCR50。 本研究对富集贝类中诺瓦克样病毒的4种方法进行了比较,确定了一种可有效从贝类中浓缩诺瓦克样病毒的方法。该方法对贝类中的病毒粒子可选择沉淀,能较大程度的去除贝类样品中含有的RT-PCR反应抑制因子。同时对4种诺瓦克样病毒RNA的提取方法进行了比较,确定了一种有效的RNA提取方法。该方法能提取完整且纯度较高的诺瓦克样病毒RNA,提高了反应的灵敏度。贝类中该病毒的检出限为8.1×102 RT-PCR50/5g贝肉,可在11h内完成对贝类中诺瓦克样病毒的富集以及检测。 本研究利用试验得到的检测方法对保定市市售的贝类进行了实际检测,共检测了25份实际贝类样品,检出了3份阳性样品,检出率为12%,阳性样品的RT-PCR产物进行测序,测序结果与流行株DQ369797.1的同源性达到92%～94%,进一步证明检测到的阳性样品是诺瓦克样病毒。