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铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生的名贵中药材,多糖是其主要药效成分之一。本论文围绕铁皮石斛多糖代谢开展研究,取得以下结果: (1)检测了298份来源于全国11个省份不同铁皮石斛样品的多糖含量,结果发现,其中222份铁皮石斛茎多糖的含量在16.4%~51.9%间,平均为32.2%,63份铁皮石斛叶多糖的含量在6.2%~18.0%间,平均为11.7%,3份铁皮石斛花多糖的平均含量为12.3%,3份铁皮石斛根多糖的平均含量为5.9%,表明不同种质、不同部位、不同产地的铁皮石斛多糖含量均存在差异。 (2)对三个铁皮石斛种质T6、T601、T29茎中多糖含量的检测结果表明,瓶苗移栽后的9个月至第二年3、4月,茎中多糖不断增加;开花后茎中多糖含量迅速下降,至第二年10月左右,茎中多糖含量再次回升,表明铁皮石斛中多糖含量与铁皮石斛的生长时期密切相关。同时发现,多糖含量与甘露糖、淀粉含量呈显著正相关,与赖氨酸、锌元素、毛兰素含量呈正相关,与茎的含水量、醇溶性浸出物和粗纤维含量呈负相关。 (3)基于本课题转录组数据,克隆分析了铁皮石斛UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(DoUGE)、半乳甘露聚糖半乳糖基转移酶(DoGalT)基因、GDP-甘露糖转运蛋白家族基因(DoGONST1、DoGONST3、DoGONST4)、甘露聚糖酶(DoMAN)。其中DoUGE在茎中特异性表达,且在不同品种中的表达丰度与多糖含量存在正相关(R2=0.94;p<0.01)关系。在营养生长阶段,DoGalT在茎中表达量最高,但在生殖生长阶段,花中表达量最高。转基因拟南芥分析结果发现DoUGE和DoGalT不仅与水溶性多糖合成有关,还能响应盐胁迫和干旱胁迫;DoGONST1、DoGONST3、DoGONST4的表达量与其茎中多糖含量相一致,在拟南芥中超表达的结果表明,DoGONST1可以大幅度增加水溶性多糖含量,DoGONST3通过增加多糖中的甘露糖含量,促进转基因植株中的多糖含量升高,DoGONST4通过增加多糖中的葡萄糖含量,促进转基因植株中的多糖含量升高,表明DoGONST1、DoGONST3、DoGONST4参与了多糖的合成。DoMAN在营养生长到生殖生长的转变期明显上调表达,与其甘露聚糖含量存在显著负相关关系。过表达DoMAN能够加快拟南芥种子的萌发,推测与其启动子区域存在的赤霉素调控元件相关。 采用RACE技术克隆得到铁皮石斛DoMYB3基因,其ORF为966bp,编码321个氨基酸,属于R2R3-MYB蛋白,与苯丙烷代谢合成的MYB蛋白聚为一类。DoMYB3在不同组织表达存在明显差异,在MeJA和低温4℃中表现出上调表达,推测DoMYB3可能参与了植物生长发育和逆境响应过程。 (4)对4月份采收的T29和T601茎中多糖的结构进行了分析,发现T29的水溶多糖为O-乙酰葡萄甘露聚糖,分子量为115.8kDa,甘露糖和葡萄糖摩尔比为6.7∶1,主要含有β-(1→4)-D-Manp和β-(1→4)-D-Glcp以及少量的β-(1→6)-D-Manp,体外对DPPH自由基的清除能力达到71.8%。T601的水溶多糖为O-乙酰葡萄甘露聚糖,分子量为60.2kDa,甘露糖和葡萄糖摩尔比为4.3∶1,主要含有β-(1→4)-D-Manp、β-(1→4)-D-Glcp和O-乙酰基,表明不同种质中多糖结构不完全一样。铁皮石斛茎中酸性多糖的组分为葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖,与中性多糖组分不同,并具有对DPPH自由基更强的清除能力。