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1目的为探讨艾烟对机体功能的影响,以及嗅觉通路在艾烟效应中的作用,基于临床的灸法应用,通过观察艾烟对膝关节损伤局部的影响,对嗅球的影响以及对脑神经递质分泌的影响,探讨艾烟环境对膝骨性关节炎关节损伤的局部作用,嗅觉通路参与艾烟效应的神经生物学和电生理作用机制,为深入探讨艾灸烟效应的作用机制以及生物学基础和研究艾灸作用机制提供实验支持。2方法通过顶空进样-气相色谱-质谱方法检测了艾烟中的物质成分,并委托第三方环境检测机构开展艾烟环境浓度检测,确定了本实验研究的艾烟浓度;采用形态学、神经电生理学、分子生物学等方法,通过观察艾烟对膝骨性关节炎模型大鼠的关节软骨超微结构以及膝关节组织液中与软骨破坏相关的炎性因子TNF-α、IL-1β以及细胞凋亡相关因子BAX和Bal-2 mRNA表达的变化,探讨艾烟环境对膝骨性关节炎关节损伤的局部作用,即探讨艾烟的有效性;通过观察不同浓度艾烟环境下,膝骨性关节炎模型大鼠嗅球超微结构、c-Fos蛋白表达,探讨不同浓度艾烟环境对嗅球损伤的作用;通过观察嗅球摘除前后,高浓度艾烟环境对膝骨性关节炎模型大鼠脑内5-HT、DA、NE和乙酰胆碱(Ach)等相关神经递质和神经调质释放的影响,初步探讨嗅觉通路参与艾烟效应的神经生物学机制;通过比较艾油吸嗅、高浓度艾烟和香烟刺激对嗅球动作电位发放的影响,初步探讨嗅觉通路电生理作用机制。3结果1)采用顶空进样-气相色谱-质谱连用方法检测,共分辨出87个色谱峰,鉴定出54个化学成分,占已分离总组分含量的88.505%,艾烟中挥发性成分主要为烷烃类,烯烃类,醛类,酸类,酯类,酚类,萜类和杂环类物质。2)以临床环境实际为基础,模拟诊室开窗的实际,采用点燃艾条后在艾灸箱中“开窗”的形式,确定了以实验浓度为0.11mg/m3、0.23mg/m3和0.45mg/m3分别作为低浓度、中浓度和高浓度艾烟为标准开展后续实验研究。3)在20000倍透射电镜下可以看到,空白组大鼠关节软骨的软骨细胞呈卵圆形,细胞及细胞膜完整,细胞表面有较多突起的微绒毛,细胞核完整,核膜清晰,染色质均匀,胞质内有线粒体、高尔基复合体以及排列整齐的丰富的粗面内质网;模型组关节软骨细胞形态不规则,胞质内见数个脂滴,脂滴体积大,细胞核裂解,线粒体、粗面内质网等细胞器消失、溶解,游离核糖体显著减少;艾烟低浓度组模型大鼠关节软骨细胞形态不规则,细胞核固缩,大部分线粒体消失,仅有个别线粒体存在,大部分粗面内质网断裂溶解;艾烟中浓度组模型大鼠关节软骨细胞形态明显异常,细胞核染色质边集,线粒体数量减少,粗面内质网显著扩张、断裂;艾烟高浓度组模型大鼠关节软骨细胞有肿胀且形态异常,微绒毛断裂变短,线粒体有空泡化变性,粗面内质网出现轻中度扩张。4)与空白组比较,模型组大鼠关节液中的TNF-α、BAX和IL-1βmRNA表达显著增多(P<0.01),Bcl-2 mRNA表达显著减少(P<0.01);与模型组比较,大鼠在不同浓度艾烟环境干预后,关节液中的TNF-α、BAX和IL-1βmRNA相对表达量降低,Bcl-2 mRNA相对表达量增多;艾烟中浓度和艾烟高浓度环境下,大鼠关节液中的TNF-α、BAX和IL-1βmRNA相对表达量显著下降(P<0.01),Bcl-2 mRNA相对表达量显著增多(P<0.01);Bcl-2 mRNA/BAX mRNA的比值在模型组中显著降低(P<0.01),在低、中、高浓度中比值逐渐升高,与模型组相比,中浓度、高浓度艾烟环境组的比值差异具有统计学意义。5)透射电镜下观察大鼠嗅球超微结构,空白组大鼠嗅球可见细胞及细胞膜完整,细胞核完整,核膜清晰,染色质均匀,核糖体分布均匀,内见溶酶体,胞质内有线粒体、以及排列整齐的丰富的粗面内质网;模型组大鼠可见嗅球细胞及细胞膜完整,核膜略扩张,线粒体少量扩张并有空泡样变性,粗面内质网有断裂;胞浆水肿,细胞浆内含有线粒体和少量核糖体;艾烟低浓度组大鼠嗅球细胞及细胞膜完整,核膜扩张,糖原体减少,线粒体少数扩张且有空泡样变性,粗面内质网扩张且断裂;艾烟中浓度组大鼠嗅球细胞核完整,核膜清晰,粗面内质网较多无扩张但有少数断裂现象,线粒体脊有些许断裂;艾烟高浓度组大鼠嗅球:细胞及细胞膜完整,细胞核完整,核膜清晰,染色质均匀,核糖体内见溶酶体。胞质内有线粒体。粗面内质网丰富但有少许断裂。6)各组嗅球颗粒层均有c-Fos蛋白标记出现,将各组图片导入JEOR801D软件并进行计算,结果表明,各组c-Fos标记细胞形态较好,组间差异不显著(P>0.05);不同浓度艾烟吸嗅对大鼠嗅球细胞凋亡有一定的影响,但与模型组比较,其平均光密度、平均灰度等均没有显著差异。7)与空白组比较,模型组大鼠脑组织中的5-HT、DA、NE和Ach含量均有所降低,但差异不具有统计学意义(P>0.05);与模型组比较,较高浓度艾烟环境下,大鼠脑组织中的5-HT、DA和Ach含量显著增多(P<0.01),NE含量有所增多但不具备统计学差异(P>0.05);嗅球摘除组大鼠脑组织中5-HT、DA、NE和Ach含量较模型组有所增加,但没有统计学差异(P>0.05);与艾烟熏灸组比较,在嗅球摘除组大鼠脑组织中DA和Ach含量显著降低(P<0.01),但5-HT和NE的含量表达没有统计学差异(P>0.05)。8)艾油吸嗅时嗅球锥体细胞每分钟放电22.0±1.3count/bin,单个神经元放电频率为0.36±0.01spikes/sec;艾烟干预时嗅球锥体细胞每分钟放电17.67±0.82 count/bin,单个神经元放电频率为0.28±0.01spikes/sec;香烟干预时嗅球锥体细胞每分钟放电11.67±1.37 count/bin,单个神经元放电频率为0.22±0.01spikes/sec,三组之间具有显著的统计学差异(P<0.05)。4结论1)艾烟可以影响KOA模型大鼠关节软骨超微结构改变,改善KOA模型大鼠关节腔的炎症状态和保护细胞凋亡;2)艾烟能够促进嗅球动作电位发放,其中含有的芳香类气味分子是诱发动作电位的主要成分;3)艾烟有助于大脑释放单胺类神经递质和乙酰胆碱,发挥大脑相应的调节作用,以嗅球为基础结构的嗅觉通路参与了艾烟对机体功能的调节。