论文部分内容阅读
知母皂苷BII为来源于中药知母的呋甾皂苷类单体化合物,可以显著改善多种拟痴呆动物模型的学习记忆功能,其作用机理为上调胆碱能N&M受体,改善脑缺血及缺血损伤。现在正在按照中药、天然药物注册分类Ⅰ进行研究开发,用于痴呆的防治。为了进行构效关系的研究,我们一直在寻找有效的方法对该化合物进行结构修饰。生物转化(Biotransformation)是利用动、植物离体细胞或器官、微生物、或它们所产生的酶等对外源性化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生化反应。与有机合成方法相比,生物转化具有工艺简单、选择性强、转化率高、副产物少、条件温和及环境友好等特点。目前为止,有关天然产物的生物转化研究较多,但对像知母皂苷BII这样的甾体皂苷类化合物的生物转化研究相对较少,特别是在其糖基化和C-3位糖链的选择性水解方面。本论文以知母皂苷BII为底物,对本实验室已保存的40多种酶及近百种微生物菌株进行活性筛选,发现一种酶(Toruzyme 3.0L)和两种微生物(黑曲霉Aspergillus niger AS 3.0739;荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens)能够转化知母皂苷BII生成其相应的衍生物。Toruzyme 3.0L是一种商品化环糊精葡萄糖基转移酶( cyclodextrin glucanotransferase, CGTase),发现其可以催化知母皂苷BII生成相对其极性增大的转化产物。经过知母皂苷BII制备级转化,通过大孔吸附树脂、薄层制备、开放C18柱层析及制备液相等分离,共得到了9个转化产物(产物1～9),并利用FAB-MS、HR-ESI-MS及NMR分析,鉴定其全部是知母皂苷BII的糖基化衍生物。并且该糖基化反应是利用非活化的糖源供体,可以在100℃下完成。黑曲霉Aspergillus niger AS 3.0739是一种常见的产糖化酶菌株,发现其在全细胞培养时可以选择性催化知母皂苷BII的C-22位羟基发生脱水反应,生成知母皂苷B(产物B1)。而从其发酵液中提取的全酶,在pH 8.0时,随着转化时间的延长,首先选择性地依次水解知母皂苷BII的C-3位糖链的糖基,得到2个次生呋甾皂苷(产物H1、H2),又水解其C-26糖链,得到1个次生螺甾皂苷(知母皂苷AIII,产物H4)。产物H1的结构为:(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羟基-5β-呋甾皂苷-3β, 26-二醇;产物H2的结构为:(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羟基-5β-呋甾-3β, 26-二醇-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷。本论文分离鉴定的一株菌-荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)可以催化知母皂苷BII生成大极性转化产物(产物H3)。对该大极性转化产物进行制备分离,再通过波谱分析,尤其是二维核磁光谱(1H-1H COSY, HSQC, HMBC)对产物H3的13C和1H进行全归属,确定产物H3的结构是:(25S)-26-O-琥珀酸酯-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羟基-5β-呋甾-3β, 26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。实现了知母皂苷BII的琥珀酸酯化,该酯化反应的酯化位点是知母皂苷BII C-26位糖链葡萄糖基的C-6’位羟基。鉴于Toruzyme 3.0L对知母皂苷BII的糖基化反应可以利用非活化糖源供体,且在100℃下还可以完成的新颜性,我们进行了其中糖基化酶的分离纯化,结构分析及酶学特性的研究。以催化知母皂苷BII发生糖基化反应为酶活筛选指标,利用凝胶色谱、离子交换层析等方法,纯化得到了其中的目的酶蛋白;经SDS-PAGE电泳检测为单一条带;然后切割目的蛋白条带,胰蛋白酶降解、MALDI-TOF/TOF和ESI-Q-TOF-MS测定,数据库检索,确定了该糖基化酶的结构,与已报道的来源于Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin-glycosyltransferase,CGTase,EC 2.4.1.19)同源,该酶分子量为78.4 kD,属于GH 13家族(α-淀粉酶家族)。以知母皂苷BII为底物,Toruzyme 3.0L最佳反应pH值为8.0,在pH 4～10范围内相对稳定;最佳反应温度为100℃,在100℃煮沸6 h后仍然能保持60%以上的活性;在最佳反应温度100℃时,反应速度很快,即使使用很少的酶液,也无法检测出该酶的反应速度;在60℃下10min达到最大催化活性。另外,本论文还发现α-淀粉酶和CGTase这些GH 13家族的酶均可以利用非活化糖源供体催化知母皂苷BII发生糖基化反应,而其他种类的淀粉酶,如γ-淀粉酶却没有这样的活性。初步探讨,该酶催化发生糖基化反应的机理可能是:首先水解含有α-1,4葡萄糖苷键的糖源,释放出被激活的葡萄糖基,然后这种葡萄糖基被随机的加成到知母皂苷BII糖链的末端葡萄糖基上。同时还首次发现了黑曲霉Aspergillus niger AS 3.0739的胞外酶在pH 8.0时可以选择性水解知母皂苷BII的糖链;荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens全细胞培养可以转化知母皂苷BII生成相应的琥珀酸酯。这些研究不仅丰富了甾体皂苷类化合物库,为进一步活性筛选及知母皂苷BII构效关系的研究奠定了基础;同时为今后指导甾体皂苷类化合物的定向结构修饰提供了理论依据。