在我国及世界范围内,肺癌的发病率及死亡率均位于常见恶性肿瘤的前列。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）为最主要的组织学类型,主要包括鳞癌与腺癌等。深入探讨NSCLC的病因及发病机制对于肺癌的有效治疗具有重要意义。长链非编码RNA（Long non-codingRNA,LncRNA）指长度大于200个核苷酸的非编码RNA,可参与细胞内X染色体沉默、基因印记、染色质重塑、转录激活、转录干扰、核内运输等多种生物过程的调节,在多种肿瘤的发生发展中具有重要作用。为了揭示NSCLC中关键lncRNA分子的作用机制,我们通过Human mRNA+LncRNA表达谱芯片检测了8对NSCLC肿瘤及其配对正常肺组织中差异分子的表达情况,发现FEZF1-AS1、Linc01296、DUXAP8及DUXAP10等lncRNAs在癌组织中显著高表达。本研究中我们主要围绕FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中的表达、功能和作用机制进行探讨,研究内容主要包括以下三方面:1.FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中的表达及其生物学作用的研究;2.FEZF1-AS1作为ceRNA调控miRNAs-靶基因参与非小细胞肺癌进展的机制研究;3.FEZF1-AS1对非小细胞肺癌中miR-516b-5p-ITGA11表达调控作用的研究。通过以上研究工作,明确FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中的作用机制,为非小细胞肺癌的病因及发病机制提供理论依据。第一部分FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中的表达及其生物学作用的研究目的:筛选并验证FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中的表达;从细胞增殖与凋亡、细胞周期分布、迁移与侵袭等方面观察FEZF1-AS1在NSCLC细胞中的作用;并初步探讨m6A修饰相关分子对FEZF1-AS1表达的影响。方法:采用Human mRNA+LncRNA表达谱芯片筛选8对NSCLC肿瘤及其配对的正常肺组织（4对鳞癌、4对腺癌）中差异分子的表达;采用qRT-PCR方法检测FEZF1-AS1在45对NSCLC肿瘤及其配对正常肺组织中的表达,并分析与临床病理特征的关系;体外培养NSCLC细胞株-H1299和H520,转染siRNA敲低细胞中FEZF1-AS1表达,分别通过CCK8法检测细胞增殖的改变、Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的变化、流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡率的变化。此外,转染siRNA敲低细胞中m6A修饰相关分子-METTL3、METTL14、YTHDF1及YTHDF2表达,观察对FEZF1-AS1表达的影响。进一步观察去甲基化药物3-脱氮腺苷（10μM）处理对H1299和H520细胞中FEZF1-AS1表达的影响。每组实验重复三次。所有数据应用SPSS Statistics 23.0统计软件进行分析,P<0.05为有显著差异。结果:1.表达谱芯片筛选结果和验证Human lncRNA/mRNA表达谱芯片筛选发现,肿瘤组织中505个lncRNAs显著上调,652个显著下调（FC≥2且P<0.05）。进一步以FC≥5且P<0.05为阈值,共筛选到20个显著上调、26个显著下调lncRNAs。从中选出15个lncRNAs在20对肺癌组织及配对的正常肺组织中进行了验证,结果发现FEZF1-AS1、DUXAP8、LINC01296、DUXAP10等在癌组织中的表达显著增加,本研究主要围绕FEZF1-AS1进行研究。2.FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中显著高表达,并与淋巴结转移相关qRT-PCR方法检测FEZF1-AS1在45对NSCLC中的表达情况。与正常肺组织相比,FEZF1-AS1在肿瘤组织中的表达显著增加（P<0.0001）,与患者淋巴结转移呈显著正相关（P=0.020）。AUC曲线进一步表明单独检测FEZF1-AS1对NSCLC具有较好的诊断意义（AUC=0.759,P<0.0001）。3.体外实验检测FEZF1-AS1在NSCLC中的生物学作用FEZF1-AS1在非小细胞肺癌细胞株H1299和H520中相对高表达。敲低FEZF1-AS1表达可显著抑制H1299和H520细胞的增殖能力（CCK8,P<0.05）和迁移能力（Transwell,P<0.05）。在侵袭实验中,si-FEZF1-AS1组较NC组穿膜细胞数减少（P<0.05）。此外,流式细胞术检测表明,敲低FEAF1-AS1后可引起H1299和H520发生G2/M期阻滞（P<0.05）,但对细胞凋亡无明显影响。4.m6A修饰相关分子以及去甲基化药物对FEZF1-AS1表达的影响利用m6A预测软件SRAMP对FEZF1-AS全长序列（2,653 bp）进行了预测,共预测到7个m6A修饰位点,提示FEZF1-AS1表达可能受m6A修饰调节。siRNA转染敲低H1299细胞中m6A修饰相关分子-METTL3、METTL14、YTHDF1及YTHDF2表达后观察了对FEZF1-AS1表达的影响。qRT-PCR检测表明,细胞中FEZF1-AS1的表达均出现一定程度的下调。与对照组相比,给予H1299和H520细胞去甲基化药物-3-脱氮腺苷处理4h,FEZF1-AS1的表达显著降低（H1299:降低81.1%;H520:降低70.6%）。初步结果提示m6A修饰可调控NSCLC细胞中FEZF1-AS1的表达。小结:1.FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中呈高表达,并且其表达与患者淋巴结转移显著正相关。结合AUC曲线分析,提示FEZF1-AS1可作为NSCLC诊断和预后相关生物标记分子。2.敲低FEZF1-AS1表达可显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、细胞周期进展、迁移与侵袭能力,提示其在NSCLC中具有癌基因作用。3.m6A修饰可影响NSCLC细胞中FEZF1-AS1的表达。第二部分FEZF1-AS1作为ceRNA调控miR-320e/940-靶基因参与非小细胞肺癌进展的机制研究目的:从ceRNA的作用角度,探讨FEZF1-AS1在NSCLC中发挥癌基因作用的可能机制。方法:核浆分离检测FEZF1-AS1在细胞中的表达定位;通过RNA结合蛋白免疫共沉淀实验（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）检测FEZF1-AS1与Ago2蛋白的结合;通过ceRNA预测分析可能与之结合的miRNAs;依据筛选结果合成miRNAs mimics文库转染细胞,检测对FEZF1-AS1表达的影响（其中以miR-320e和miR-940对FEZF1-AS1的抑制最为显著）;体外实验观察过表达miR-320e和miR-940对H1299和H520细胞增殖、细胞周期分布、迁移与侵袭的影响;筛选并验证FEZF1-AS1-miR-320e和FEZF1-AS1-miR-940调控的下游靶基因;RNA pull-down实验验证FEZF1-AS1与miR-320e、miR-940的结合作用。每组实验重复三次。所有数据应用SPSS Statistics 23.0统计软件进行分析,P<0.05为有显著差异。结果:1.FEZF1-AS1表达的定位及ceRNA预测分析核浆分离实验表明FEZF1-AS1主要分布于细胞浆中,可能以ceRNA机制发挥其作用。为了检测FEZF1-AS1与miRNAs间的ceRNA作用,我们利用Ago2抗体进行了RIP实验。与阴性对照Ig G组相比,Ago2组结合的FEZF1-AS1水平显著增加。在此基础上,进一步结合第一部分表达谱芯片检测结果对FEZF1-AS1进行了ceRNA预测分析。筛选出12个miRNAs并制成模拟物文库转染H1299和H520细胞,结果表明miR-320e与miR-940过表达可显著抑制FEZF1-AS1表达。2.miR-320e和miR-940在非小细胞肺癌组织中的表达利用GEO数据库（GSE53882）检索miR-320e和miR-940在397例NSCLC组织及151例正常肺组织中的表达情况,表明miR-320e（P<0.05）和miR-940（P<0.001）在癌组织中均显著低表达。在前述45例NSCLC及其配对肺组织中,miR-320e在55.56%（25/45）肿瘤组织中显著低表达,而miR-940在31.11%（14/45）肿瘤组织中显著低表达。3.miR-320e和miR-940在非小细胞肺癌细胞中的生物学作用将miR-320e和miR-940 mimics转染H1299与H520细胞,观察过表达miRNAs对NSCLC细胞在增殖、迁移与侵袭能力的影响。与对照组相比较,过表达miR-320e、miR-940均可显著抑制H1299与H520细胞的迁移与侵袭能力（P<0.05）,并是对细胞的增殖能力有一定的抑制作用。4.FEZF1-AS1作为ceRNA参与miR-320e对E2F1的调控作用进一步对miR-320e调控的下游靶基因进行了筛选与验证,包括E2F1和SKA3基因。WB检测结果证实,过表达miR-320e可显著抑制E2F1蛋白表达。同时,敲低H1299和H520细胞中FEZF1-AS1表达可降低E2F1在mRNA与蛋白水平的表达。RNA pull-down实验结果表明,与Bio-miR-NC相比,Bio-miR-320e-WT转染组FEZF1-AS1显著被富集（P<0.05）,而Bio-miR-320e-MUT组未检测到FEZF1-AS1表达。上述检测基础上,进一步通过回复实验观察了FEZF1-AS1参与miR-320e对E2F1的调控作用。结果表明,过表达FEZF1-AS1可一定程度逆转miR-320e对E2F1的抑制作用。综合结果表明,NSCLC中FEZF1-AS1作为ceRNA参与miR-320e对E2F1的调控作用。5.FEZF1-AS1作为ceRNA参与miR-940对SRC的调控作用对miR-940调控的下游靶基因进行了筛选与验证,包括SRC和SKA3基因。WB检测结果表明过表达miR-940可显著抑制SRC蛋白的表达。同时,敲低H1299和H520细胞中FEZF1-AS1表达可降低SRC在mRNA与蛋白水平表达。RNA pull-down实验结果表明,与阴性对照Bio-miR-NC相比,Bio-miR-940-WT转染组FEZF1-AS1显著被富集（P<0.05）,而Bio-miR-940-MUT组未检测到FEZF1-AS1表达。回复实验结果表明,过表达FEZF1-AS1可一定程度逆转miR-940对SRC的抑制作用。综合结果表明,NSCLC中FEZF1-AS1作为ceRNA参与miR-940对SRC的调控作用。小结:1.FEZF1-AS1主要分布在细胞浆内,并且与Ago2蛋白结合,提示FEZF1-AS1与miRNAs间存在ceRNA作用机制。2.过表达miR-320e及miR-940可显著抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭与增殖能力,提示其在NSCLC中具有抑癌基因作用。3.FEZF1-AS1作为ceRNA对miR-320e-E2F1、miR-940-SRC的调控是其参与NSCLC发生发展的重要机制。第三部分FEZF1-AS1对非小细胞肺癌中miR-516b-5p-ITGA11表达调控作用的研究目的:以mRNA-FEZF1-AS1为依据,进一步揭示FEZF1-AS1在NSCLC中的调控机制。方法:将mRNA表达谱芯片检测结果与ceRNA预测结果取交集,以mRNA为依据筛选出FEZF1-AS1可能相关的9个mRNAs;采用qRT-PCR方法检测敲低FEZF1-AS1对上述基因在mRNA水平的变化（ITGA11显著下调）;Western blot方法进一步验证FEZF1-AS1对ITGA11蛋白表达的影响;采用qRT-PCR方法检测ITGA11在45对NSCLC肿瘤及其配对正常肺组织中的表达情况;并通过体外实验观察敲低ITGA11对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;筛选并验证与ITGA11结合的miRNAs;进一步通过RNA pull-down实验验证FEZF1-AS1与516b-5p的结合作用。每组实验重复三次。所有数据应用SPSS Statistics 23.0统计软件进行分析,P<0.05为有显著差异。结果:1 FEZF1-AS1相关mRNA的筛选与验证将ceRNA预测分析结果与8对非小细胞肺癌组织的mRNA芯片结果进行交叉比对,筛选出ITGA11、RHOV、ONECUT2、SOX4、MARK4、UBN1、COL1A1、PRKAB2、PIP5K1A共9个可能与FEZF1-AS1相关的靶基因。在筛选基础上,利用qRT-PCR方法检测了敲低FEZF1-AS1后上述9个基因表达的变化。结果表明,ITGA11 mRNA表达随FEZF1-AS1的敲低而显著降低。Western blot结果进一步证实敲低细胞中FEZF1-AS1表达可显著抑制ITGA11蛋白的表达。2 ITGA11在NSCLC中的表达及其生物学作用qRT-PCR检测结果表明,ITGA11 mRNA在45对NSCLC肿瘤组织中的表达显著高于配对的正常肺组织（P<0.05）。转染siRNA敲低ITGA11表达后检测了对NSCLC细胞功能的影响。与对照组相比,敲低ITGA11后H1299和H520细胞的增殖活性、迁移能力均明显受到抑制（P<0.05）。在侵袭实验中,H1299细胞si-ITGA11组较NC组穿膜细胞数减少（P<0.05）,但在H520细胞中并未见明显变化。3筛选验证与ITGA11结合的miRNAs结合本研究中ceRNA预测结果及已经验证ITGA11结合的miRNAs,共筛选出包括miR-126a-3p、miR-29b、miR-145、miR-486-3p、miR-516b-5p及miR-584-3p在内的6个miRNAs进行验证。qRT-PCR检测结果表明,过表达miR-516b-5p可显著抑制ITGA11 mRNA水平的表达。Western blot结果进一步证实过表达miR-516b-5p可显著抑制ITGA11蛋白表达。4 miR-516b-5p在非小细胞肺癌中的表达和生物学作用在45对组织中检测miR-516b-5p的表达情况,结果表明miR-516b-5p在肿瘤组织中的表达显著性低于正常肺组织（P<0.01）。过表达miR-516b可显著抑制H1299和H520细胞的增殖、迁移和侵袭能力。5 miR-516b-5p与FEZF1-AS1的结合作用转染生物素标记的Bio-miR-516b-MUT、Bio-miR-516b-WT以及阴性对照Bio-miR-NC,进行RNA pull-down实验检测FEZF1-AS1的富集情况,可见WT组出现FEZF1-AS1的明显富集（P<0.05）。结合前面miR-516b过表达后FEZF1-AS1的表达减少,可知miR-516b-5p与FEZF1-AS1具有结合作用,共同竞争与下游基因ITGA11的结合。6 FEZF1-AS1-miR-516b-5p-ITGA11的回复实验分别转染NC、miR-516b mimics、pc DNA3.1 FEZF1-AS1+miR-516b mimics,48小时后提取蛋白检测ITGA11表达。相较于NC组,miR-516b mimics组ITGA11表达降低,共转染组较miR-516b mimics组有所回升。小结:1.ITGA11在NSCLC肿瘤组织中的表达显著高于匹配的正常肺组织,敲低ITGA11可显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示其在NSCLC中发挥重要癌基因作用。2.miR-516b-5p在NSCLC肿瘤组织中的表达显著低于匹配的正常肺组织,过表达miR-516b-5p能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示其在NSCLC中发挥重要抑癌基因作用。3.FEZF1-AS1作为ceRNA调控miR-516b-5p-ITGA11通路参与NSCLC的进展过程。结论:1.FEZF1-AS1在非小细胞肺癌中呈高表达,并且其表达与患者淋巴结转移显著正相关。敲低FEZF1-AS1表达可显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、细胞周期进展、迁移与侵袭能力。结合AUC曲线分析提示,FEZF1-AS1在NSCLC中具有癌基因作用,可作为NSCLC诊断和预后相关的生物标记分子。2.FEZF1-AS1主要分布在细胞浆内,并且与Ago2蛋白结合,提示FEZF1-AS1可通过ceRNA作用机制参与NSCLC的进展过程。3.过表达miR-320e、miR-940、miR-516b-5p可显著抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭与增殖能力,提示上述miRNAs在NSCLC中具有抑癌基因作用。4.FEZF1-AS1作为ceRNA调控miR-320e-E2F1、miR-940-SRC以及miR-516b-5p-ITGA11通路从而参与NSCLC的发生发展过程。5.m6A修饰参与NSCLC细胞中FEZF1-AS1的表达。