目的:SM22α是calponin家族中的一种actin结合蛋白,可以促进actin肌丝成束。有证据表明SM22α在平滑肌细胞中能够发挥张力感应的作用。多项研究表明,小凹（caveolae）和横管（T-Tubules）是心肌细胞的重要张力转导结构。本文旨在研究SM22α敲除对小鼠心脏功能的影响及其潜在机制。方法:以SM22α敲除小鼠为对象,复制主动脉弓缩窄模型（transverse aortic constriction,TAC）。通过心脏超声技术评估小鼠心功能,western blotting,RT-PCR,免疫荧光等技术研究相关分子的表达与分布特征,运用免疫共沉淀技术研究SM22α与心脏小凹（caveolae）标志蛋白caveolin-3的相互作用,运用荧光共聚焦显微镜记录心肌细胞横管（transverse tubular systems,T-Tubules）系统完整性以及钙离子释放情况,透射电子显微镜技术分析小凹结构特征,利用IonOptix系统检测完整心肌细胞的收缩功能以及肌小节钙敏感性。利用共聚焦显微镜技术检测透化后的肌小节钙敏感性。结果:1.SM22α敲除小鼠心脏功能减弱1.1野生型成年小鼠心肌细胞中表达SM22α为研究SM22α在心脏中的功能,首先需明确心脏中是否有SM22α的表达。由于心脏中存在着高密度的冠状血管系统,而血管平滑肌富含SM22α,为排除心脏冠状血管对实验结果的影响,我们用急性分离并纯化心肌细胞进行检测比较。通过western blotting技术我们在野生型成年小鼠的心脏组织匀浆以及心室肌细胞匀浆中检测到了 SM22α蛋白的表达。1.2 SM22α敲除小鼠心脏功能降低正常状态下的成年SM22α敲除小鼠左室射血分数（52.805±0.658%,n=162）略低于野生型小鼠左室射血分数（55.469±0.611%,n=150）约5%,该差别具统计学意义（P<0.01）。SM22α敲除小鼠收缩末期左室后壁厚度（left ventricular posterior wall,systolic;LVPW,s）（0.812 ± 0.009 mm,n=162）显著性小于野生型小鼠 LVPW,s（0.875±0.012 mm,n=145,P<0.001）。SM22α敲除小鼠ANP,BNP,β-MHC的mRNA水平显著性上升,提示心脏张力应激状态异常。1.3心脏负荷过载（pressure overload）导致SM22α敲除小鼠更快发展为心衰前面的数据提示,尽管敲除小鼠心功能仍在正常范围,但已处于应激状态,因此在面对心脏负荷过载（pressure overload）的情况时可能会出现更严重的问题。为了验证我们的猜测,通过主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）增加小鼠心脏后负荷,以检验SM22α敲除小鼠是否更倾向于发展为心衰。TAC后两周时的野生型小鼠心功能无明显变化,但SM22α敲除小鼠在TAC后两周就出现明显心功能降低,TAC前左心室射血分数为55.20 ±1.73%,TAC两周后降为48.42 ±1.44%（n=35,P<0.0101 vs.SM22αKO control;P<0.001 vs.WT）。TAC后四周的野生型小鼠心功能显著性下降,左心室射血分数降至 49.29 ± 1.18%（P<0.001 vs.WT control）,SM22α敲除小鼠心脏功能进一步下降,左心室射血分数降至43.76±3.15%（P<0.05 vs.WT,P<0.001 vs.SM22α KO control）。生存曲线分析表明 SM22α敲除小鼠TAC以后死亡率大于野生型小鼠（WT,3/20;SM22α KO,11/26;Fig.1-3C）。主动脉弓缩窄四周导致SM22α敲除小鼠HW/BW,LW/BW主动脉弓缩窄后的变化均显著性高于野生型小鼠。我们的数据提示,尽管野生型小鼠和敲除小鼠通过长期（八周）负荷过载均发展为心衰且无显著性差异,但敲除小鼠心功能下降的速度明显快于野生型小鼠。1.4野生型小鼠长期负荷过载导致SM22α表达增多。接下来我们比较了野生型小鼠TAC后心肌细胞内SM22α的表达情况。Western blot结果显示,TAC后4周,心肌细胞内SM22α表达增多约70%（Sham 组,SM22α/GAPDH:0.36 ± 0.05,n=5;TAC 后,SM22α/GAPDH:0.63 ± 0.09,n=5,P<0.05）。RT-PCR 结果显示,TAC四周心肌细胞内SM22α显著性升高约60%（Sham组:1.00±0.10,n=21;TAC后:1.63±0.14,n=12,P<0.001）。我们的数据表明,长期负荷过载可导致野生型小鼠心肌细胞SM22α表达水平增加。2.缺失SM22α降低小凹依赖的心肌细胞张力感应,导致收缩动力学异常2.1 SM22α敲除小鼠心肌细胞小凹数量减少,结构异常透射电镜结果显示,SM22α敲除小鼠心肌细胞小凹密度约为野生型小鼠的53%,且SM22α敲除小鼠心肌细胞小凹结构发生显著性改变,小凹开口直径变大,为野生型小凹的两倍。由于小凹密度与结构在细胞张力感受方面发挥的重要作用,我们的结果提示SM22α敲除小鼠心肌细胞的张力感受能力异常。2.2 SM22α敲除小鼠心脏中CAV3与actin的结合显著减少心肌细胞中促进小凹形成及维持小凹结构稳定的关键分子为caveolin-3（CAV3）,CAV3通过与皮层肌动蛋白肌丝相互作用维持小凹结构稳定。因此接下来我们在野生型小鼠与SM22α敲除小鼠心脏中运用免疫共沉淀技术检测了 SM22α是否可以与CAV3结合,以及CAV3、actin与SM22α间的相互关系。Co-IP结果显示,野生型小鼠心脏蛋白裂解液中,用actin或者SM22α的抗体可将CAV3沉降下来,反之亦然。SM22α敲除小鼠心脏中CAV3与actin的结合显著减少,提示SM22α参与actin介导的小凹形成。2.3 SM22α敲除小鼠心肌TCAP定位改变,提示张力感应异常Telethonin（Tcap）是一个主要存在于心肌和骨骼肌Z line的结构蛋白,对于心肌细胞张力感应调节发挥重要的作用。接下来我们利用WB技术检测野生型小鼠及SM22α敲除小鼠心脏中Tcap表达以及分布情况。结果表明,虽然张力感应相关分子Tcap的mRNA以及蛋白表达水平在野生型小鼠及SM22α敲除小鼠心肌细胞中均无显著性差异,但其细胞内分布发生显著性变化。野生型小鼠Tcap沿着Z线规律性分布,但SM22α敲除小鼠心肌细胞Tcap分布紊乱胞浆内散在出现很多Tcap荧光信号,细胞核内也检测到Tcap荧光信号,提示Tcap入核。2.4 SM22α敲除小鼠心肌细胞收缩能力变（略）弱,动力学参数改变接下来我们利用IonOptix心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统检测单个心肌细胞的收缩功能。我们发现SM22α敲除小鼠心肌细胞的收缩幅度略低于对照组野生型小鼠,但差异无统计学意义。但是,SM22α缺失的心肌细胞肌小节收缩速率（1.455±0.123）显著性高于对照组（1.147± 0.077,P<0.05）,且到达峰值时间缩短（WT:0.080±0.004;SM22α KO:0.059±0.003,P<0.001）,提示SM22α缺失导致肌小节钙敏感性异常。2.5 SM22α敲除小鼠心肌细胞肌小节钙敏感性升高,最大收缩幅度降低利用完整的以及saponin透化的小鼠心肌细胞测量得到小鼠心肌细胞肌小节长度的钙敏感性曲线,我们发现SM22α缺失的心肌细胞肌小节钙敏感性高于对照组,但最大反应幅度则低于对照组。3.缺失SM22α的心肌细胞横管结构紊乱,钙释放异常3.1 SM22α敲除小鼠心肌细胞横管结构完整性被破坏横管系统（transverse tubular systems,T-Tubules）是心肌细胞中维持钙调控的重要膜结构,横管的破坏是导致心衰的重要原因之一。我们的结果表明,野生型小鼠心肌细胞横管结构完整,而SM22α敲除小鼠横管系统完整性破坏严重。维持心肌细胞横管与肌浆网靠近的结构分子j unctophilin-2（JPH2）,是横管成熟的重要分子。在SM22α敲除小鼠心肌细胞中JPH2的mRNA较野生型小鼠下降60%,蛋白水平下降约30%。Co-Ip结果表明,SM22α与JPH2存在相互作用。3.2 SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变同步性破坏完整横管结构是保证钙瞬变同步的前提。接下来我们检测SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变情况。共聚焦显微镜钙成像结果显示,尽管幅度并未降低,SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变（calcium transient）同步性显著性下降,且达峰时间显著性延迟。我们的数据提示基础状态下,SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变同步性破坏,该数据与SM22α敲除小鼠心肌细胞横管结构完整性破坏相一致。3.3 SM22α敲除小鼠心肌细胞钙稳态失衡横管的破坏还会直接导致心肌细胞内二联体（dyad）,又称钙释放单元（calcium release unit,CRU）的解体,会引起心肌细胞钙紊乱。接下来我们进一步分析SM22α敲除小鼠心肌细胞的钙稳态及钙火花。野生型心肌细胞钙火花频率（calcium sparks frequency,CaSpF）为 1.84±0.70 sparks/100 μm/s,而SM22α敲除鼠心肌细胞钙火花频率显著增多,为6.13± 1.01 sparks/100 μm/s（P<0.05）。钙火花频率升高会导致舒张期肌浆网钙流失,从而降低肌浆网钙储备。我们的结果表明,SM22α敲除的心肌细胞钙储备显著性降低。结论:SM22α缺失小鼠基础状态心脏功能略降低,心室壁厚度变薄。在心脏负荷增加的情况下SM22α缺失的小鼠更容易出现心衰症状。SM22α缺失对心肌细胞张力敏感性结构caveolae的密度和结构以及T-Tubules均产生显著性影响,而且改变了心肌细胞收缩装置的动力学参数以及钙敏感性,使基础状态下心脏处于应激状态,可能是导致心肌细胞对负荷改变适应能力降低的主要原因。