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目的:构建转染后能表达神经修复功能蛋白的载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸纳米微球<poly(ethylene glycol)-poly(lactin-co-glycolic acid)-BDNF-nanoparticles,PEG-PLGA-BDNF-NPs>,探讨其转染外源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后对细胞生物学功能的影响,以及移植装载PEG-PLGA-BDNF-NPs的能表达具有神经修复功能的BDNF的外源性NSCs对脑缺血再灌注损伤大鼠的治疗作用。方法:1、PEG-PLGA-BDNF-NPs的制备及表征,纳米粒携带质粒的包封率、质粒载量测定及体外释药实验:采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备装载BDNF基因质粒的PEG-PLGA纳米微球转染复合体。用扫描电镜和透射电镜表征纳米微球的形貌,粒度电位分析仪测量纳米微球的粒径及Zeta电位;测定纳米微球对BDNF基因质粒的包封率和载药量,检测PEG-PLGA纳米微球转染复合体的体外缓释质粒的情况。2、外源性NSCs的提取、鉴定及纳米微球转染复合体生物学功能测定:取孕12-14天的大鼠,颈椎脱臼处死后取胎鼠海马区提取NSCs进行培养及分化培养,培养至第3代进行NSCs鉴定、增殖鉴定及分化后鉴定;倒置显微镜观察纳米微球转染复合体对NSCs形态的影响,并用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响;荧光倒置显微镜观察NSCs胞吞纳米微球转染复合体后的分泌作用;Western-blot及RT-PCR检测其BDNF的分泌能力。3、PEG-PLGA-BDNF-NPs转染NSCs移植治疗大鼠脑缺血:(1)大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型(MACO/R)的建立及NSCs移植:取雄性大鼠,随机分为假手术组及模型组,利用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,模型组随机分为实验组、NSCs对照组及PBS对照组,模型建立3天后将实验组进行转染了PEG-PLGA-BDNF-NPs的NSCs移植,NSCs对照组进行未转染的NSCs的移植,PBS对照组用磷酸盐缓冲液(PBS)代替NSCs,假手术组不做处理。(2)大鼠神经功能评估及脑梗死体积计算:在NSCs移植后第1d、3d、7d、14d、28d对3组大鼠分别进行神经功能评分。移植后第28d行大鼠头颅MRI扫描并计算脑梗死体积,冰冻切片双标免疫荧光染色评价MACO大鼠脑缺血区的神经重建情况。结果:1、制备了包载BDNF基因的PEG-PLGA纳米微球,微球的粒径约为200 nm,粒径均一;包封率及载药量均较高,具有一定的缓释效果。2、分离培养出了具有不断增殖能力,表达神经巢蛋白的NSCs;并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。载BDNF基因的PEG-PLGA纳米微球高效转染NSCs,且转染不会引起显著细胞毒性;Western-blot及RT-PCR检测显示其大量表达BDNF。3、对照组及实验组大鼠均有神经功能恢复,而实验组更显著,m-NSS评分差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠脑梗死体积比对照组小,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备得到安全高效的PEG-PLGA-BDNF纳米微球。并首次构建了装载PEG-PLGA-BDNF-NPs的能表达具有神经修复功能的BDNF的外源性神经干细胞系。装载PEG-PLGA-BDNF-NPs的NSCs移植对促进大鼠脑缺血再灌注损伤后受损区域神经元生存能力的提高和神经功能的修复作用更为显著。