论文部分内容阅读
背景与目的:乳腺癌作为女性面临的重大威胁,当今对之采取的主流治疗手段还是以手术为基础的放化疗联合治疗,考虑到其带来的各类严重的副反应或并发症,传统中药以及靶向基因结合治疗越来越为人们所重视和接受。本实验探讨ZIC1基因联合苦参碱对高转移性人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖能力、黏附能力、迁移能力及凋亡的影响,进而为乳腺癌的治疗探索新思路。方法:1.首先将慢病毒载体p LV-Zic1-PGK-puro转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,转染48小时后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况,并培养筛选后得到稳定传代的细胞克隆。2.以GAPDH作为内参对照,蛋白质印迹法(Western blot法)检测ZIC1基因转染后在MDA-MB-231细胞中的表达。3.之后以空载体转染的人乳腺癌MDA-MB-231细胞及ZIC1基因稳定转染的细胞作为研究对象进行细胞毒实验。选取50,100,200,400,800mg/L浓度梯度的苦参碱分别作用于空载体组与转染组48h,四甲基唑蓝法(MTT法)分别测量苦参碱对之作用后的生长抑制率,并筛选出苦参碱处理48h的半抑制浓度(IC50)。4.以上述48h检测出的IC50为苦参碱后续实验的浓度,把细胞人为地划分为四组,即A空载不加药组(阴性对照组),B空载加药组,C转染不加药组和D转染加药组。对四组细胞分别采用如下:(1)细胞黏附试验及MTT法检测细胞黏附能力,并计算各组细胞的黏附率;(2)细胞划痕/迁移实验检测细胞迁移能力,观察各组细胞在24h,48h,72h下的迁移程度;(3)流式细胞术检测细胞凋亡,分析各组细胞的凋亡率及凋亡分布情况。结果:1.携带ZIC1基因的慢病毒载体p LV-Zic1-PGK-puro转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,ZIC1在细胞中的表达情况:48h荧光显微镜检测到大量绿色荧光蛋白,转染率达90%。2.蛋白质印迹结果显示,ZIC1蛋白在稳定转染细胞中均有表达,而在未转染细胞均无表达。3.药物的细胞毒实验,经MTT检测,发现苦参碱对空载及转染的MDA-MB-231细胞均呈现增殖抑制作用,具有剂量依赖性。其中,浓度为200mg/L的苦参碱作用于空载细胞、转染细胞48h后细胞增殖抑制率分别为49.21%和52.42%左右,抑制率最接近50%。于是我们选取200mg/L浓度的苦参碱,作为后续的标准实验浓度。4.在细胞黏附实验中,MTT测得200mg/L苦参碱处理各组细胞48h后,转染不加药组(64.13%)和空载加药组(49.17%)的细胞黏附率均低于阴性对照组,而转染加药组细胞的黏附率约为31.23%,均明显低于其余三组(P<0.05);在细胞迁移实验中,随时间的延长每组细胞迁移的距离逐渐增大,即具有时效性,并且同一时间段的MDA-MB-231细胞迁移的距离,以转染加药组迁移距离最短,相对迁移率最低(P<0.05);在细胞凋亡实验中,48h的凋亡率以转染加药组细胞最高,为34.78%±1.82,其次为空载加药组(26.3%±1.28)和转染不加药组(24.24%±1.14),最低为阴性对照组(7.99%±1.07)。结论:1.包裹ZIC1基因的慢病毒载体p LV-Zic1-PGK-puro稳定转染的乳腺癌MDA-MB-231细胞中ZIC1的表达较慢病毒空质粒转染细胞中的表达明显增强。2.苦参碱作用转染细胞或空载细胞48小时的50%抑制浓度(IC50)约为200mg/L。3.ZIC1基因表达上调或苦参碱单独作用均可以明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、黏附与迁移,并诱导该细胞的凋亡。4.ZIC1基因与苦参碱联合作用抗肿瘤效果更为明显,能发挥很好的抗MDA-MB-231细胞生长、迁移及促凋亡的作用。因此,可以认为中药苦参碱联合ZIC1基因靶向治疗可能对乳腺癌发挥协同抑制作用,推测它们结合会产生比较理想的抗肿瘤治疗成效。