细菌性脑膜炎是新生儿时期最常见也最严重的中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）感染，尽管抗生素广泛使用，但是世界各地仍有发病，尤其是发展中国家，细菌性脑膜炎仍然是新生儿最常见的死亡原因之一，且幸存者中枢神经系统后遗症的发生率为30%。现已证明，大肠杆菌Kl株是引起新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴性杆菌。临床上绝大部分新生儿脑膜炎病例是由细菌入血传播至中枢神经后导致的结果。细菌进入中枢神经系统是细菌性脑膜炎发生的必要条件。但是脑部的血管结构，尤其是微血管内皮的结构和身体其他部位的血管内皮有很大的不同，具备其独有的通透特征，对于血液中的物质具有非常强的透过选择性，因此，致病菌如何侵入CNS成为人们认识细菌性脑膜炎发病机制以及预防此类疾病的关键。 脑血管的通透性与非神经系统中的血管不同，具有屏障作用，被称为血，脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）。血脑屏障是以脑微血管内皮细胞（Brain microvascular endothelial cell，BMEC）、星形胶质细胞（Astrocyte）和周细胞（Pericyte）共同构成的结构和功能屏障，其主要结构和功能基础是BMEC以及细胞间的紧密连接（Tight junction，TJ），它们可以保护大脑免受血循环中的微生物和毒素损害。很多脑内的疾病包括中枢神经感染都与BBB的防御功能被破坏有关。因此，建立体外血脑屏障模型，一方面可以为研究致病微生物侵入血脑屏障的机制提供模型，另一方面，又避免了大规模、长期的动物实验所带来的工作量大、试验成本高、并且可能受体内其他因素影响等问题。 前期研究发现，引起新生儿脑膜炎的E．coli K1的致病力与其基因岛GimA上的ibeA基因有关，ibeA编码的IbeA蛋白是GimA上唯一能介导细菌侵入BMEC的侵袭素，是细菌的毒力因子。新近研究表明IbeA可以通过与BMEC表面的受体Vimentin （Vim）结合，从而介导E．coli K1侵入BBB。由此可见Vim可以作为阻断Ecoli K1侵袭的靶点而用于细菌性脑膜炎的防治。为了研究Vim对于侵袭的影响，本研究使用一种能改变Vim蛋白结构的抗生素：格尔德霉素（Geldanamycin，GA），初步观察其对E．coli K1侵袭BMEC的抑制效果。因此，本文的目的是建立体外BBB模型，并以E．coli K1株的临床分离株E44的野生型和敲除ibeA的突变株（△ibeA E44）初步研究E．coli脑膜炎发病和防治机理。 一、大鼠脑微血管内皮细胞原代培养的建立。 选择3周龄的大鼠，以酒精消毒后取出大脑。将大脑放置于冰上，仔细剥离脑膜，然后分离皮质。用金属筛网轻轻研磨，使大块的灰质分离为碎末状，之后将浸泡了灰质碎末的培养悬液转入匀浆器匀浆，再经葡聚糖梯度离心以及胶原酶/组织分散酶消化的过程后，即可得到纯度较高的脑微血管段，并种植于胶原蛋白包被过的25c㎡塑料培养瓶中行进培养。显微镜下观察，培养24小时的BMEC呈长梭形，或呈现椭圆形；随后细胞岛逐渐增大，至第7天左右细胞岛融合成单层排列的细胞。单层细胞经过消化、稀释后，种植于玻璃盖玻片上，待细胞长满50%至80%时，经Ⅷ因子相关抗体及羊抗兔IgG-FITC依次孵育后，用荧光显微镜观察。镜下计数细胞，可见阳性细胞达90%以上。证明该方法能成功分离大鼠BMEC，建立原代BMEC体外培养模型。 上述方法分离培养的BMEC较免疫磁珠法分离获得的高纯度的BMEC更接近在体状态，因后者可丧失在体状态下的一些重要特性，如紧密连接的通透性增高，特异性抗原表达减少，并且这些改变随着细胞传代而加重，最终丧失血脑屏障的特性。 二、大肠杆菌E44株侵袭脑微血管内皮细胞的研究。 1、E．coli E44野生型和突变型生长曲线的观察。 依据细菌生长曲线检测的常规方法，将E44、10A-23和ZD1株种植于LB中过夜培养的菌液作为备用菌液，每个菌种准备12支试管，每支试管各加入5ml LB培养液以及20μl备用菌液，然后将试管标记，放入细菌培养箱培养。在0至第20个小时内选择12个时间点，每到一个选定的培养时间取出一支试管放入4℃冰箱待测，最后一支试管培养时间为20小时。待全部试管取出后，以OD600为光波密度检测细菌悬液的OD值，并且绘制其生长曲线。三种细菌取等量的平台期细菌悬液，梯度稀释后涂板培养、计数。计数结果进行单因素方差分析。结果显示，三种菌株均在培养14小时后进入平台期，且三条生长曲线几乎重合，平台期细菌悬液涂板计数结果十分接近，提示三种菌株的生长能力和生长特点十分相似。比较它们的生长能力及特点，可以帮助我们排除突变株可能存在的生长能力缺陷所导致的侵袭率改变。 2、E．oli E44侵袭时间和细菌侵袭浓度的确定。 侵袭时间的确定：用24孔板培养HBMEC，并且培养E44，进入平台期后测OD值并调整浓度，以细菌/细胞=100：1为侵袭比例进行细菌细胞共同培养。侵袭时间分为5个组，分别为0．5h、1h、1．5h、2h和2．5h。之后用庆大霉素培养液培养一小时，再去除庆大霉素，裂解细胞，将细胞裂解后的悬液等比例梯度稀释，涂布培养平皿，过夜培养，计数，计算E44株侵袭率，用单因素方差分析比较不同侵袭时间的E44株侵袭率的差异。结果显示，随时间的延长，侵袭率呈现出上升的趋势，但在1至2小时之间出现平台期，因此，选定1．5小时作为细胞细菌的共同培养时间。 细菌侵袭浓度的确定：根据时间测定结果，选取1．5小时作为侵袭时间，将菌液分为5个浓度组：分别是104CFU/ml组、105CFU/ml组、106CFU/ml组、107CFU/ml组以及108CFU/ml组。实验步骤与上述步骤相同。用单因素方差分析比较侵袭结果。结果显示，在体外实验选择的浓度的范围内，浓度对于侵袭率的变化影响并不明显，但是如果细菌浓度过高可能会加速细胞的死亡、脱落，难以准确测定侵袭率。因此，出于方便准确计数单菌落数的角度考虑，可将最适细菌浓度定位为106CFU/ml至107CFU/ml之间。细菌侵袭浓度和时间的检测有助于确定最合适的侵袭条件。 3、E． coli E44野生型和突变型对BMEC侵袭力的比较。 根据上述实验测定的时间和浓度，按照相同的侵袭实验方法，同时检测E44、10A-23（E44 ibeA：TnphoA）以及ZD1（△ibeA E44）的侵袭率，计数结果用单因素方差分析比较侵袭结果。结果显示，10A-23和ZD1的侵袭率明显下降，并且与E44侵袭率有显著差异（F=29．153，P<0．001）。表明突变株和野生株对BMEC的侵袭力有显著差异，证明ibeA基因对致病菌株的侵袭力密切相关。BMEC模型可用于研究病原微生物与宿主细胞的相互作用。 4、格尔德霉素（Geldanamycin，GA）和纯化IbeA蛋白对E44侵袭的抑制。 参照上述侵袭实验方法。在侵袭实验前，用不同浓度的GA（0．2μmol/L、0．5μmol/L和0．8μmol/L）和纯化的IbeA蛋白（1．5μg/well）加入BMEC中孵育，GA孵育6小时，IbeA蛋白孵育1小时，使之与Vimentin受体结合，然后再进行侵袭实验，并以E44野生株（106CFU/ml）的侵袭率为对照。结果显示，用三种浓度的GA处理的实验组与对照组E44株的侵袭率比较育明显下降（F=11．5，P<0．001），其中GA浓度为0．5μmol/L和0．8μmol/L及纯化的IbeA蛋白处理的实验组降低尤为显著，证明Vim受体降解药GA在体外能有效抑制E44株对BMEC的侵袭，可开发成为临床防治细菌性脑膜炎的药物。