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利用基因组定点修饰的方法改良作物特性对于植物育种和基因工程是至关重要的。基因组编辑的方法最先证明在细菌和哺乳动物细胞中能够发挥作用,但最近它们也成功地运用在植物基因组修饰中。近几年,序列特异性核酸酶(Sequence specific nuclease,SSN)得到了快速发展,其中CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统由sgRNA(Small guide RNA)与Cas9蛋白两个元件组成,因而构建表达单元十分简便,在植物基因组编辑中得到了广泛利用。在动物中,CRISPR/Cas9系统对基因组编辑效率很高,通过将大量的sgRNA和Cas9蛋白通过显微注射进入胚胎单细胞中,形成大量双等位基因突变。然而在植物中,通常是利用农杆菌介导的愈伤组织的稳定转化方法将CRISPR/Cas9转入植物细胞中。CRISPR/Cas9通过T-DNA进入伤口细胞中,并整合到快速分化的细胞基因组中。CRISPR/Cas9等外源基因的表达先经过瞬时较高水平的表达后会在RNA induced Silencing Complex(RISC)系统的作用下表达量会急剧下降。在gRNA选择合理地情况下也能在单细胞阶段获得纯合突变,但这种理论上最理想的情况只存在于少量的报道中,实际操作中很难达到。然而T0代的转基因植株的形成需要数周到数月,在这个阶段里sgRNA/Cas9复合体一直在表达,所以往往会在T0代检测到嵌合体突变及杂合突变。相比于动物,在植物中由同源修复介导的双链断链修复发生的概率也很低,并且在植物体内还存在对外源RNA转录后沉默机制,使Cas9蛋白不能在体内大量表达。目前绝大数植物突变体是通过杂合的T1代转基因(携带突变位点)自交而获得非转基因突变体。但是,如果CRISPR/Cas9系统效率足够高,理论上完全可以在T1代中获得纯合突变体。因此降低RISC系统对CRISPR/Cas9的影响,提高稳定CRISPR/Cas9系统在T0代中的作用,在T1代便获得非转基因的突变体是目前亟待解决的问题。番茄是全世界最重要的经济作物之一,并且因为番茄基因组序列已被测序和精细分析,是研究果实发育和成熟过程的重要的模式植物。本研究以番茄为实验材料,通过引入P19m蛋白(沉默抑制蛋白)提高CRISPR/Cas9编辑效率,使快速获得纯合转基因植物变得可行,进行基因敲除并获得不包含转基因元件的转基因突变体,甚至通过HDR敲入目的基因片段,达到精确定点突变。(1)通过生物信息学分析,在SlPDS(Solyc03g123760.2.1)的2号外显子上设计2个gRNA,在SlCNR(Solyc02g077920.2.1)的3号外显子上设计2条gRNA,在SlHD-ZIP6500(Solyc08g066500)的2号外显子设计1个gRNA,在SlBES1(Solyc02g063010.2.1)的2号外显子上设计3个gRNA,在SlBES4(Solyc01g094580.2.1)的2号外显子上设计2个gRNA,在SlBES7(Solyc03g005990.2.1)的2号外显子上设计3个gRNA;(2)利用Overlap PCR对P19进行突变并进行GB驯化;(3)通过GoldenBraid载体构建方法构建含有P19m及不含有P19m的SlPDS gRNA-Cas9载体,通过叶片注射瞬时侵染发现含有P19m的侵染样品突变率更高并且突变类型也更多,通过稳定转化,得到了一株含有P19m的T0代突变植株,出现白化表型;(4)通过GoldenBraid载体构建方法构建含有P19m的SlBES1、SlBES4、SlBES7和SlHD-ZIP6500 gRNA-Cas9载体,进行稳定转化,并验证T1代突变体的编辑比率。经测序,得到的20株SlBES7 gRNA-Cas9 T1代植株都是突变植株,其中30%的突变株的突变效率为100%,3个突变植株为纯合突变。检测到了7个杂合突变株系,8个嵌合体突变株系。在对突变类型的分析中发现,大部分突变都发生在gRNA3靶位点上,包含8个突变类型,其中超过80%的突变都为缺失2碱基,其次是插入1个碱基的突变,占了10%,而缺失五个以上碱基的突变频率最低。并且在这20个株系中有4个非转基因突变体。得到了4株SlHD-ZIP6500的转基因阳性突变植株,突变率都达到了100%,并且都为纯合突变,突变类型基本都是缺失8个碱基;(5)设计SlCNR通过HDR精准突变的供体DNA片段,通过GoldenBraid载体构建方法构建SlCNR-U6-gRNAs-donorDNA-Cas9载体,并施加RS-1,通过瞬时侵染以及稳定转化验证RS-1能否在植物中提高HDR事件发生的概率,在转基因植株中没有检测到定向突变,推测RS-1没有发挥作用;(6)从PEAQ-HT载体上克隆CPMV RNA-2 5’UTR和3’UTR片段,并通过GoldenBraid驯化,构建在Cas9两端,进而构建了含有CPMV元件的SlPDS gRNA-Cas9载体。