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实验目的:1.确定不同类型的体细胞,包括小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF)以及小鼠造血干/祖细胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPC)重编程速率以及效率的差异。2.探究Wnt通路调控对不同类型细胞重编程影响的异同。3.阐明Wnt信号通路下游Tcf/Lef1转录因子在不同类型成体细胞的效应,解析其DNA结合位点的差异,揭示Wnt信号对各细胞重编程的效应的分子基础。实验方法:首先,利用已经成功建立的二次诱导体系,获得能够直接添加强力霉素(Doxycycline,Dox)启动内源Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc表达来诱导重编程的MEF及HSPC,对重编程得到的克隆的形成的速率和效率进行统计比较。接着,依据已经得到的RNA-seq结果,利用Gsk3β抑制剂CHIR99021以及IWR1-endo对Wnt信号通路进行激活或者抑制,同样通过统计重编程得到的克隆的形成速度以及数量来确定Wnt信号通路对不同类型细胞重编程的影响。接着,利用实时荧光定量PCR和Western Blot在mRNA水平和蛋白水平检测Wnt通路中核心因子β-catenin以及下游Tcf/Lef1转录子家族成员的表达水平,利用Co-IP来确定MEF和HSPC中β-catenin与Tcf/Lef1的相互作用,结合小分子抑制剂引起的表达水平改变情况,确定在不同类型细胞中起到关键作用的转录因子,并利用过表达以及敲降的手段明确它们在响应细胞中的功能。最后利用Ch IP-seq深度解析不同类型细胞中关键转录因子结合的DNA序列,分析Wnt通路调控的下游靶基因,揭示Wnt信号对不同类型各细胞重编程的区别效应的分子基础。实验结果:1.Wnt的激活与抑制对MEF和HSPC重编程具有不同的作用模式利用CHIR99021来激活Wnt信号通路能够促进HSPC的重编程,抑制MEF的重编程。而利用IWR1-endo来抑制Wnt信号通路对HSPC以及MEF的重编程影响均不大。2.MEF及HSPC对Wnt信号的响应不同,引起不同的b-catenin以及Tcf/Lef1效应HSPC中β-catenin的表达水平较MEF低,而加入CHIR99021后发现能够明显提高HSPC中β-catenin的蛋白水平,但MEF中β-catenin对CHIR99021的响应并不显著。CHIR99021的加入在MEF以及HSPC中引起Tcf/Lef1家族四种蛋白的响应不同。3.Wnt信号通路促进小鼠胚胎干细胞干性的维持激活Wnt信号能够明显提高ESC中多能性基因Nanog的表达水平。Tcf3的敲降能够阻碍ESC的EB分化中分化基因的表达,将多能性基因的表达维持在相对较高水平。而Tcf1在ESC中的作用并不显著。实验结论:1.不同细胞类型对Wnt信号的响应有差异。2.Wnt信号激活引起β-catenin的变化,并会在不同程度上改变Tcf/Lef1四个转录因子的水平,从而可能通过不同的下游靶蛋白导致不同细胞类型对Wnt信号的响应差异。