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目的黄连素作为降糖药物对胰岛β细胞所起的调节作用是多方面,本研究初步探讨黄连素通过影响P糖蛋白表达调节胰岛素分泌的潜在机制。方法(1)体外培养大鼠胰岛素瘤细胞株832/13 INS-1细胞(简称832/13细胞);(2)用不同浓度(1uM、5uM、10uM、20uM)的黄连素干预细胞72小时,萃取细胞膜蛋白,以Western Blot技术检测P糖蛋白、胰岛素分泌相关膜蛋白和凋亡相关蛋白表达的变化,包括小窝蛋白1(caveolin-1)、L型钙离子通道(L-type calcium channel protein,Cav1.3)、Bcl-2 和 Caspase-3;(3)用上述不同浓度的黄连素干预细胞72小时后进行高糖刺激胰岛素分泌试验(glucose stimulated insulin secretion,GSIS),应用放免法测定胰岛素细胞内含量和细胞外分泌量;(4)依照P糖蛋白调控基因abcb1a及abcb1b分别设计RNAi序列下调832/13细胞中P糖蛋白的表达;提取细胞总RNA,应用实时定量PCR检测细胞abcb1a及abcb1bmRNA表达量的变化;萃取832/13细胞膜蛋白,应用Western blot检测P糖蛋白表达量、胰岛素分泌相关蛋白和凋亡相关蛋白表达量的变化;(5)放免法测定RNAi下调P糖蛋白后细胞内胰岛素含量以及GSIS的变化。结果(1)黄连素干预细胞72h后,Western Blot显示不同浓度黄连素对细胞凋亡蛋白Bcl-2及Caspase3的表达均未产生显著影响(P>0.05);在干预浓度为5uM、10uM时,L型钙离子通道Cav1.3表达明显增加(P<0.01);在干预浓度为1uM、5uM、10uM时,P糖蛋白及Caveolin1表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);(2)黄连素干预没有对细胞内胰岛素含量产生显著影响;(3)GSIS实验中,不同干预浓度下各组之间基础胰岛素分泌量(basal insulin secretion,BIS)没有明显的变化,但是在干预浓度为5uM、10uM时高糖刺激下的胰岛素分泌显著增高(P<0.01);(4)RNAi转染细胞48小时后,显微镜下可见超过90%的832/13细胞呈现红色荧光,表明转染效果满意;(5)实时定量PCR探测结果显示abcb1a和abcb1b的mRNA表达量被其相对应的RNAi明显下调,同RNAi阴性对照组相比具有统计学意义(分别为P＜0.05和P＜0.01);Western blot结果表明P糖蛋白表达量被abcb1b静默序列显著下调,而abcb1a静默子对P糖蛋白表达量影响与阴性对照相比没有统计学差异;P糖蛋白表达量下调后,细胞Cav1.3及Caveolin1蛋白表达量也出现下调,同RNAi阴性对照相比具有统计学意义,显示了上述3种脂筏的表达呈现正相关性(分别为P＜0.01和P＜0.05);凋亡蛋白Bcl-2及Caspase3蛋白表达在RNAi干扰组中均无明显差异(P>0.05);(6)在GSIS试验中,abcb1b静默组BIS相比阴性对照组明显增加(P＜0.05),而GSIS明显减少(P<0.05);胰岛素合成总量在各组无明显变化(P>0.05)。结论(1)在干预浓度为1uM～10uM范围内,黄连素可以增加GSIS的分泌,但对基础胰岛素分泌无明显影响;(2)不同浓度的黄连素干预下凋亡蛋白表达及胰岛素合成总量未见明显变化,提示细胞凋亡和胰岛素合成不是黄连素调节胰岛素分泌的主要原因;在黄连素干预浓度为1uM～10uM范围内,P糖蛋白表达明显增加,提示P糖蛋白参与黄连素调节胰岛素分泌过程的可能性。另外,胰岛素分泌相关的蛋白(Cav1.3、Caveolin1)表达量明显增加,提示P糖蛋白调节GSIS的潜在机制与“脂筏”相关(P糖蛋白、Cav1.3、Caveolin1均为脂筏结构中的重要蛋白);(3)RNAi实验中,实时定量PCR印证了我们的前期发现,即abcb1b为胰岛β细胞P糖蛋白的主要编码基因;(4)P糖蛋白表达下调时增加基础胰岛素分泌以及减少高糖刺激下胰岛素分泌,其中的调节网络可能涉及了 Cav1.3、Caveolin1等脂筏相关蛋白;(5)P糖蛋白表达下调时,凋亡蛋白及胰岛素合成总量未见明显变化,提示细胞凋亡和胰岛素合成不是P糖蛋白调节胰岛素分泌的主要原因;(6)综合两部分实验,我们推测黄连素对胰岛素分泌的影响可能是通过P糖蛋白、Cav1.3、Caveolin1相互之间的作用而引起的,其中P糖蛋白可能是这一调控网络的核心,具体机制有待于进一步证明。