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H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)自上个世纪90年代以来已经广泛在我国和世界各地流行,不仅仅给养禽业造成了巨大的经济损失,而且给公共卫生安全造成的隐患不可估量,对人类的健康也构成了巨大的威胁。在我国,独特的地理环境及养殖模式为此病的发生、传播提供了有利条件。而免疫压力及活禽市场的存在又为H9N2亚型禽流感病毒的重组和变异提供了必要条件。本研究对2011-2013年问华东地区家禽的临床病料和活禽市场棉拭样品进行病毒的分离鉴定,对分离到的H9N2亚型AIV进行全基因组序列测定和遗传进化分析；对分离到的两株H10亚型AIV H10N8和H10N9进行了生物学特性和遗传进化分析；评价了我国华东地区当前流行株中自制候选疫苗和目前普遍采用的F98疫苗的疫苗保护效力。木研究为禽流感的防控提供了流行病学资料及疫苗选择的实验依据。1.2011-2013年华东地区禽流感病毒的流行病学调查以及分离鉴定2011-2013年在江苏省及附近地区采集禽类的临床病料340份,在华东地区活禽市场采集棉拭样品3100份,将病料和棉拭样品处理后接种鸡胚分离病毒,以血凝和血凝抑制试验结合RT-PCR鉴定病毒,共分离31株H5亚型禽流感病毒、36株H9亚型禽流感病毒和31株新城疫病毒(NDV)。其中,棉拭中H5亚型AIV、H9亚型AIV和NDV的分离率分别为0.42%、0.52%和0.45%,病料中三种病毒的分离率分别为5.29%、5.88%和5.00%。活禽市棉拭样品病毒分离结果显示,可分离到H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10和H11等8种亚型禽流感病毒,鸭和鸡的样品中各分离6种亚型禽流感病毒,而鹅的样品中分离到3种亚型禽流感病毒。鸡样品中禽流感病毒血清型的多样性为病毒的变异提供了有利条件。2.36株H9N2亚型禽流感病毒全基因组的遗传进化分析对36株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因核苷酸序列的遗传进化分析表明, Y280亚系(Clade h9.4.2.4)在2011年后成为华东地区的主要流行株(34株),F98亚系(Cladeh9.4.2.1)和G1亚系(Clade h9.4.1)仅各有1株。值得注意的是这些不同Clade之间的病毒有较大程度的变异,相同Clade之间的病毒也在出现较大的变异,如Clade h9.4.2.4(Y280亚系)的毒株已进化出更多的小分支,且各小分支与Y280株同源率也只有90.9%-94.7%。分离株HA基因的228位氨基酸均为甘氨酸(Gly,G),226位类F98株和类G1株为嗜禽源细胞的谷氨酰胺(Gln,Q)其余均为嗜哺乳动物细胞的亮氨酸(Leu,L)。对神经氨酸酶(NA)基因的分析表明,所有的NA基因均属于欧亚种系中的F98亚系,且在茎部缺失了63-65位3个氨基酸；而对其内部基因的分析中表明,目前华东地区内部基因的整体变异情况不大。但是Qa/WX3/13株中PA基因、NP基因、NS基因明显不同于其他分离株,分别属于Y439亚系、G1亚系、G1亚系。耐药性的分析表明,对达菲(奥赛他韦)和对扎那米韦产生拮抗作用的位点没有明显的突变,但是除了Qa/WX3/13株外其余分离株均对金刚烷胺产生了耐药性。3.两株H10亚型禽流感病毒的起源分析和生物学特性测定对从鸡以及野鸡体内分别分离到H10N9以及H10N8亚型病毒进行生物学特性测定和遗传进化分析。IVPI结果显示两株H10亚型毒株均为低致病型禽流感病毒。全基因序列测定与遗传进化分析结果显示,该两株分离株所有基因片段均属于欧亚系。H10N9毒株中NA基因与2013年流行的H7N9禽流感高度同源,提示其极有可能是此次暴发的NA供体。H10N8株与2013年暴发的感染人的H10N8江西株JX346同源性较差,该分离株可能是候鸟迁徙路线上的基因重组型病毒。4.H9N2候选疫苗株的筛选以及免疫效果评价在H9N2病毒遗传进化分析的基础上进一步进行抗原性分析和生物学特性分析,筛选出了2株分别位于不同遗传进化分支上的2株疫苗候选株Ck/yz4/12和Dk/Yc2/13进行免疫,并以F98疫苗株作为对照。两次免疫后14天以106EID50剂量的亲木株滴鼻点眼攻毒,评介疫苗的免疫保护效力。病毒排毒显示Ck/yz4/12株灭活疫苗免疫鸡可以对同源毒株和异源毒株的攻击提供良好的免疫保护,可作为H9N2亚型禽流感灭活疫苗的候选株。