论文部分内容阅读
第一部分黑质内注射脂多糖对多巴胺能神经元的毒性作用和小胶质细胞活性的影响目的观察脂多糖(LPS)对黑质多巴胺能神经元的损毁作用以及对小胶质细胞活性的影响。方法60只大鼠随机分为正常对照、1d、7d、14d和60d组,每组12只；采用立体定向技术向大鼠单侧黑质内注入LPS建立LPS-帕金森病动物模型,于注药造模后不同时间点(1d、7d、14d和60d)采用经腹腔注射阿朴吗啡诱发动物旋转行为；采用酪氨酸羟化酶(tyrosine-hydroxylase,TH)免疫组化观察DA能神经元损害变化；特异性抗体OX-42标记不同时间点小胶质细胞的激活情况；采用高效液相色谱-电化学法测定纹状体和黑质部位多巴胺(DA)及其代谢产物含量；采用Fluoro-Jade B染色法检测黑质的变性神经元。结果单侧黑质内注入LPS后14d-60d的大鼠经腹腔注射阿朴吗啡后可诱发动物旋转行为；单侧黑质内注入LPS后1d-60d各组,黑质TH+细胞数分别较对侧减少12%-71.5%；其损伤侧纹状体和黑质DA及其代谢物含量降低了28.2%-65.7%；LPS注射后1d组、7d组,同侧纹状体TH+染色与对侧相比无显著性；LPS注射后14d,纹状体TH+染色出现淡染,60d时纹状体TH+染色明显淡染,与对侧差异显著；1周时Fluoro-Jade B染色可见染色阳性神经元；LPS注射后1d-60d黑质均可见活化的小胶质细胞。结论黑质注入LPS可诱导小胶质细胞活化和黑质多巴胺能神经元变性死亡。第二部分黑质内注射脂多糖对小胶质细胞MHCⅡ表达的影响目的观察黑质内注入脂多糖(LPS)后对黑质小胶质细胞MHCⅡ(主要组织相容性复合物Ⅱ)表达的影响。方法采用立体定向技术向大鼠单侧黑质内注入LPS建立LPS-PD动物模型,分别于注药后1、7、14、60d时采用免疫组化法检测MHCⅡ阳性细胞；Western blot检测黑质小胶质细胞MHCⅡ蛋白的表达；双标荧光染色法检测p47phox (NADPH氧化酶标志物)和iNOS在MHCⅡ阳性小胶质细胞的表达。结果注射LPS后1d,注射侧黑质区始出现MHCⅡ阳性细胞,7d时达高峰,14d时减少,60d时仅见少量的OX6阳性细胞。Western blot检测结果也有类似的趋势。双标荧光染色法检测到p47phox和iNOS在MHCⅡ阳性小胶质细胞均有表达。结论研究结果表明,黑质内单次注射LPS可激活黑质小胶质细胞并表达MHCⅡ;而且,LPS可诱导MHCⅡ阳性小胶质细胞同时表达iNOS和NADPH氧化酶。激活iNOS和NADPH氧化酶从而产生大量ONOO可能是LPS诱导多巴胺能神经元变性的机制之一。第三部分多西环素下调小胶质细胞MHCⅡ的表达及其对黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用目的在LPS-PD模型大鼠,探讨多西环素对LPS诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用及其机制。方法动物随机分为3组：正常对照组、LPS组和多西环素预处理组；采用LPS黑质内立体定向注射建立PD模型；免疫组化染色法观察多西环素预处理前后黑质多巴胺能神经元和MHCⅡ阳性小胶质细胞的变化；高效液相色谱-电化学检测仪检测纹状体多巴胺(DA)、DOPAC含量的变化；Western blot检测黑质小胶质细胞MHCⅡ蛋白的表达。结果多西环素预处理后,黑质残存多巴胺能神经元由LPS组的37.86±5.43%上升到78.57±4.28%(P<0.01)；纹状体DA及DOPAC含量分别由LPS组的4.89±0.27和0.70±0.0.7上升到7.00±0.34和1.10±0.10(P<0.01)；腹腔注射阿朴吗啡诱导动物旋转的平均圈数由LPS组的207.71±13.61次/30min减少到79.86±11.76次/30min(P<0.01)；而黑质致密部MHCⅡ阳性细胞数量由LPS组的834.80±82.41减少到354.20±59.36(P<0.01);Western blot检测MHCⅡ蛋白的表达也明显减少。结论多西环素能够抑制LPS诱导的黑质多巴胺能神经元变性,它可以通过下调小胶质细胞MHCⅡ的表达来实现其神经保护作用。第四部分多西环素对LPS诱导的BV-2细胞MHCⅡ表达的抑制作用研究目的在BV-2细胞模型,研究多西环素对LPS诱导的BV-2细胞MHCⅡ表达的影响及其分子机制。方法BV-2细胞作为小胶质细胞的替代细胞。1.按常规方法培养BV-2细胞细胞；2.分组及处理：①对照组：不加任何特殊处理；②脂多糖组：脂多糖(100ng/ml)与BV-2细胞共孵育24小时；③多西环素预处理组(多西环素+LPS)：BV-2细胞在6孔板分别与多西环素(三个浓度梯度：50uM100uM200uM)预孵育30分钟,然后,细胞再用脂多糖(100ng/ml)处理24小时；④多西环素对照组；细胞免疫荧光共聚焦显微镜观察。3.Westen Blot检测MHCⅡ、IRF-1、phospho-STAT1、phospho-PKCα蛋白的表达；4.G66976预处理BV-2细胞,Western blot检测MHCⅡ蛋白的表达；5.RT-PCR检测CⅡTAmRNA的表达。结果1.细胞免疫荧光显示,分别用三种浓度(50uM、100uM、200uM)多西环素预处理后,BV-2细胞MHCⅡ的表达减少,并有量-效关系；2. Westen Blot显示,多西环素预处理后,BV-2细胞的MHCⅡ蛋白表达减少,三种浓度梯度显示有量-效关系(P<0.01)；3.多西环素(100uM)预处理后pSTAT1、IRF-1蛋白的表达无显著变化(P>0.05)；4. Go6976明显减弱由LPS诱导的BV-2细胞MHCⅡ表达(P<0.01)；5.多西环素预处理能明抑制由LPS诱导的CⅡTAmRNA表达(P<0.01)；6.多西环素预处理能明显抑制由LPS诱导的PKCα的磷酸化(P<0.01)。结论研究初步证实多西环素预处理能够抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞MHCⅡ的表达；它对MHCⅡ表达的抑制效应部分是通过干预PKC来实现的。