研究背景心肌肥厚是心脏对于压力负荷或者容量负荷所产生的适应性反应,是一种缓慢、复杂而且合并诸多因素参与的动态过程,通常是由心脏的基础疾病如心脏瓣膜病、高血压病、先天性心脏病、心肌缺血等导致。心肌肥厚在宏观上主要表现为心室腔缩小、心室壁增厚,而在微观上则以心肌细胞增大、心肌纤维增粗或者成簇样改变为主要表现。在心肌肥厚发生的早期,其可以降低心室壁的压力,维持心脏的功能,保证外周组织器官的血供。然而随着压力或者容量负荷的持续存在,心肌肥厚的进一步进展,伴随着心肌细胞凋亡、心肌纤维化等的发生,其终将发展成心力衰竭,甚至导致死亡。因此,深入探讨心肌肥厚的发生发展机制、寻找心肌肥厚的有效治疗靶点和治疗策略,具有非常重要的意义。花生四烯酸是生物体内含量最为丰富的不饱和脂肪酸之一。它可通过细胞色素P450表氧化酶代谢途径代谢成为环氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs)。研究证实,EETs在心血管系统中有着诸多的保护作用,比如EETs可以舒张血管、降低血压,可以抑制动脉粥样硬化以及抑制主动脉瘤形成等。同时,研究还表明,EETs在心肌肥厚的发生发展过程中具有良好的保护作用,可以预防心肌肥厚的发生,甚至达到治疗心肌肥厚以及心力衰竭的目的。然而截至目前,EETs抵抗心肌肥厚的具体作用机制尚未明了。结合国内外的研究,我们推测过氧化物酶体增殖物激活受体α (Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha, PPARa)很有可能介导了EETs的抗心肌肥厚作用。因此,本课题以PPARa缺陷(PPARa null)小鼠作为研究对象,通过重组腺相关病毒(recombinant Adeno Associated Virus, rAAV)系统介导小鼠心脏高表达CYP2J2基因以及对照的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein GFP)基因,并采用血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)皮下微泵植入诱导心肌肥厚,以探讨CYP 2J2过表达对心肌肥厚的作用及其与PPARa的关系,并对其分子机制进行深入探索。研究方法和结果：1.首先,我们在293T细胞中通过三质粒共转染的方法成功包被携带有CYP 2J2基因和GFP基因的的重组腺相关病毒,即rAAV-2J2和rAAV-GFP,并对其进行纯化。纯化后将其感染细胞检测感染效率,并且通过尾静脉注射注入至动物体内,4周后留取动物的心脏、血液和尿液,采用Western blot技术和real time RT-PCR的方法检测心脏组织中CYP 2J2的蛋白和mRNA的水平,并采用酶联免疫吸附实验检测小鼠血、尿中11,12-EET、11,12-DHET、14,15-EET以及14,15-DHET的水平。结果表明,我们所包被的病毒具有很高的感染效率,而且其可以介导CYP2J2在小鼠心脏中表达,同时与对照组相比,接受rAAV-2J2病毒组的血、尿中EETs和DHETs的水平明显升高。2.为了验证CYP2J2介导的抗心肌肥厚作用是否与PPARα有关,我们以8周大的雄性PPARαnull小鼠以及相同背景的野生(Wild type, WT)小鼠作为研究对象,并通过小鼠尾静脉注射携带有CYP 2J2基因和GFP基因的重组腺相关病毒,采用皮下微泵植入给予Ang Ⅱ (1.5 μg·Kg-1·min-1)持续刺激。两种小鼠均分为如下4组：NS+ rAAV-GFP组、NS+rAAV-2J2组、Ang Ⅱ+rAAV-GFP组、Ang Ⅱ+rAAV-2J2组,每组8只。在Ang Ⅱ干预两周后,通过小鼠超声系统,对小鼠的心室腔大小和心室壁厚度等进行检测。并且通过心导管技术以及Millar系统对小鼠的心脏血液流变学功能进行检测。检测结果表明,无论是在WT小鼠还是PPARa null小鼠中,Ang Ⅱ可以明显的诱导小鼠心脏心室壁增厚,心室腔缩小以及心室内压力最大变化速率降低。同时,在WT小鼠中,CYP 2J2过表达可以明显的抑制Ang Ⅱ的作用,但是在PPARa null小鼠中,CYP2J2却不能发挥抑制Ang Ⅱ的效应。3.在上述检测之后,将动物人性化处死并分离心脏,观察心脏大小,记录心脏重量。采用苏木素-伊红染色以及WGA染色观察小鼠心肌细胞面积,同时应用real time RT-PCR方法对小鼠心脏组织中心肌肥厚标志物(βMHC和BNP)进行检测,并提取心脏的总蛋白和胞浆胞核蛋白组分,采用Western blot技术检测心脏中ERK1/2.MAPK的激活水平,IκBα的表达情况和NFκB的激活情况。结果显示,无论是在野生小鼠还是PPARa null小鼠,Ang Ⅱ可以明显的诱导心脏增大、增重,促进心肌细胞面积增大,诱导心肌肥厚标志物(βMHC和BNP)的表达,并促进MAPK (ERK1/2、MAPKP38)和IκBα的激活,促进NFκB的核转移。而且在WT小鼠中,将Ang Ⅱ+rAAV-GFP组与Ang Ⅱ+rAAV-2J2组相比,CYP2J2过表达可以抑制心脏增大、增重,抑制心肌细胞面积的增大以及PMHC和BNP的表达增加,这一作用可能与其抑制MAPK和NFκB通路的激活有关。然而,在PPARa null小鼠中,CYP2J2过表达却不能发挥类似的效应。4.另外,我们还以大鼠心肌细胞系H9c2细胞以及原代提取的大鼠乳鼠心肌细胞作为研究对象,并外源性加入EETs以及PPARa特异性阻断剂GW6471,观察EETs对于Ang Ⅱ的促心肌肥大的作用。在体外研究中,我们采用F-actin染色观察心肌细胞的面积,并采用real time RT-PCR方法对心肌细胞中PMHC和BNP的表达进行检测,同时提取细胞总蛋白和胞浆胞核蛋白组分,采用Wenstern blot技术检测细胞中Cav-1、ERK1/2、MAPK-P38以及IKBα的激活情况和胞浆胞核NFκB的表达。此外,我们还采用了免疫沉淀的方法,检测细胞中Ras-GTP的表达,即Ras的激活情况。研究结果表明,与对照组相比,单纯Ang Ⅱ刺激可以明显的诱导的心肌细胞增大,诱导细胞中PMHC和BNP的表达增加,同时激活了Ras/MAPK和NFκB通路,而加入11,12-EET干预可以显著的抑制Ang Ⅱ所诱导的心肌细胞增大、抑制βMHC和BNP的表达、抑制Ras/MAPK和NFκB通路的激活,然而11,12-EET拮抗Ang Ⅱ诱导的心肌肥大的这一效应,可以被14,15-EEZE以及PPARa特异性阻断剂GW6471所阻断。同时我们还观察到,11,12-EET干预可以明显的诱导Cav-1的表达,而GW6471则可以阻断11,12-EET的作用。以上结果表明,11,12-EET可以通过PPARa调控Cav-1的表达。5.为了进一步的验证PPARa与Cav-1表达调控之间的关系,我们通过转录预测网站在Cav-1启动子的保守区预测到了PPARa的转录结合位点,构建了含有不同长度的Cav-1的启动子区的截短克隆,通过PPARa在细胞中高表达PPARa并采用荧光报告基因系统检测PPARa是否可以结合Cav-1的启动子区并启动下游基因的表达。同时,我们还使用了染色质免疫沉淀的方法,以Cav-1启动子区的多段引物进行PCR反应,再次验证检测PPARa与Cav-1启动子区是否可以结合。研究结果表明,对于上游500bp(-8到-492)以及上游1250bp(-8到-1278)的截短克隆中,与对照组相比,PPARa高表达组荧光素酶活性显著增高。染色质免疫沉淀的结果也表明,与对照组相比,PPARα高表达组中可以扩增出更多的-199至-455的Cav-1启动子片段,而其他引物所扩增出的产物在两组间没有明显的差异。因此,我们的结果表明,PPARα可以与Cav-1启动子区的-199到-455区域发生结合,促进Cav-1的表达。6.最后,我们在原代提取的大鼠乳鼠心肌细胞中,采用siRNA介导Cav-1的沉默,并使用F-actin染色、real time RT-PCR方法以及Western blot方法观察Cav-1在EET发挥抗心肌肥厚过程中的作用。结果表明,与对照组相比,Ang Ⅱ可以明显的促进心肌细胞面积增大、βMHC以及BNP的表达增加,刺激MAPK和NFκB通路的激活,将Ang Ⅱ组与Ang Ⅱ+11,12-EET组相比,11,12-EET干预可以显著的抑制Ang Ⅱ的效应,但是将Ang Ⅱ+11,12.EET组与Ang Ⅱ11,12-EET+Cav-1 siRNA组相比,Cav-1沉默可以显著的抑制11,12-EET的作用,促进Ang Ⅱ所诱导的心肌肥大.结论：1.在体内研究中,Ang Ⅱ微泵植入可以明显的诱导心肌肥厚,包括心脏的形态学改变(心室壁增厚、心脏增大)、血液流变学改变(心室内压力变化速率下降、心室舒张未期压力增高等)、病理学改变(心肌细胞面积增大)和分子层面改变(心肌肥厚标志物表达增加),而Ang ⅡCYP 2J2过表达可以明显的抑制Ang Ⅱ所诱导的心肌肥厚,并且这一作用可能是由PPARa介导的；2.在离体研究中,Ang Ⅱ干预可以明显的刺激心肌细胞发生心肌肥大,外源性加入11,12-EET可以明显的抑制Ang Ⅱ所诱导的心肌肥大,而这一效应可以被PPARa特异性阻断剂GW6471所阻断。3. CYP 2J2过表达及其代谢产物EETs可以通过激活PPARa,上调Cav-1的表达,进一步抑制Ras的活性以及MAPK(ERK1/2以及MAPK-P38)的激活,同时抑制IκBα的降解以及NFκB-P65亚基的核转移,从而抑制AngⅡ所诱导的心肌肥厚。