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钛种植体与骨良好的结合是口腔种植技术成功的保证,种植体表面处理是影响骨结合的重要因素。研究表明,具有表面多孔结构的钛种植体,不仅可以利于细胞外间质中蛋白的附着,利于细胞的粘附生长,还可以减少种植体与骨组织之间的弹性模量差异,提高种植成功率。钛骨TixOs(?)(Leader-Novaxa,Milan,Italy)是商品化的,利用激光金属直接成型技术制造的多孔表面种植体。它的弹性模量与牙槽骨非常接近,并且很好的模拟了牙槽骨网状结构形态;表面有200-400 μm,约70-90%互联相同的多孔结构,另外还有突起的钛球增加粗糙度,可诱导成骨细胞渗入200微米厚的表层,为新骨生长提供空间,增加了骨-种植体的机械结合,保证了种植体在牙槽骨中的稳固。研究表明,TixOs(?)取得了很好的临床效果。但是,TixOs(?)同传统钛种植体一样,植入初期缺乏生物活性及骨诱导活性。在本论文中,我们利用脉冲激光沉积技术(PLD)在TixOs(?)表面沉积了羟基磷灰石(HA)涂层,改善了钛骨的生物活性。利用BMP-2促成骨核心区段P20的成骨效能提高了 TixOs(?)的促成骨活性;利用(Glu)6的骨靶向性,起到缓释P20的作用,提高其利用度;利用RGD有效促进细胞粘附的作用,提高P20的促成骨效率。通过短肽合成技术将三种短肽连接成一条具有新颖功能的智能生物信号肽链,并将其吸附在HA涂层上,构成新型复合种植体材料TixOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD。选择小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)为实验对象,证明了新构成的复合种植体相比于TixOs(?),表现出更好的促成骨效能。具体研究内容如下:一、TixOs(?)表面制备稳定的、结晶度高的HA涂层。我们采用PLD技术在多孔的TixOs(?)表面制备HA涂层。改变PLD的输出能量、脉冲数的制备条件,通过扫描电子显微镜(SEM)、聚焦离子束(FIB)系统观察HA膜沉积在TixOs(?)表面的形态,通过能量色散X射线光谱(EDS)半定量涂层的成份与结晶度,对比得出在TixOs(?)上最佳的沉积涂层的条件,即在激光脉冲为20K、输出能量为300mJ的条件下可制备出Ca/P原子比为1.68(接近靶材HA薄膜的1.65),且表面均匀致密的涂层。在最佳条件下制备涂层,通过SEM评估涂层的厚度大概为135nm,通过X射线光电子能谱(XPS)进一步验证涂层的化学组成,得到OH-/PO43-比率与起始材料的非常接近。通过EDS-mapping显示涂层均匀分布在TixOs(?)表面。通过在模拟体液中的浸泡实验,证明了涂层的良好稳定性。通过CCK-8的方法检测了 TixOs(?)-HA无细胞毒性,同样用CCK-8的方法测细胞增值率,表明TixOs(?)-HA 比TixOs(?)具有更好的生物活性。研究表明我们采用PLD技术,在TixOs(?)表面可以制备出分布均匀,化学成分计量比与纳米级HA靶材一致,结晶度高,组织致密,与基底结合良好的HA涂层;制备出的TixOs(?)-HA比TixOs(?)具有更好的生物活性。二、智能生物信号肽链(Glu)6-P20-RGD的合成和生物活性评价。我们利用短肽合成技术合成 P20、(Glu)6-P20、(Glu)6-RGD、(Glu)6-P20-RGD 四种多肽,其中目标肽为(Glu)6-P20-RGD,以1平方厘米光滑Ti-HA为载体,探讨目标肽中各活性区段肽的功能,及(Glu)6-P20-RGD对前成骨细胞生物行为影响。以1平方厘米的平滑钛片(Ti)-HA为载体,分别吸附P20、(Glu)6-P20、(Glu)6-RGD、(Glu)6-P20-RGD四种多肽,利用BCA法对不同时间点及不同浓度多肽的吸附率进行测试,结果表明含有(Glu)6的多肽具有良好的骨靶向性,并且每平方厘米Ti-HA的最佳吸附短肽条件为60 μg/mL和60 min,通过面积换算得到TixOs(?)-HA的最佳吸附短肽条件为90μg/mL和60 min;通过3D光学显微镜观察MC3T3-E1小鼠前成骨细胞在四种Ti-HA-多肽表面上的形态,CCK-8法检测细胞粘附率及相对增值率,得出RGD可以增加多肽对MC3T3-E1的粘附率;通过对碱性憐酸酶(ALP)活性、骨钙素(OCN)水平的检测,得出多肽中的P20可以有效促进MC3T3-E1的成骨分化。研究表明,(Glu)6-P20-RGD多肽具有骨靶向性缓释、促细胞粘附及增殖、促骨分化的生物活性。三、新型植入材料TixOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD对MC3T3-E1细胞生物学行为的影响及其机制。采用PLD技术在最佳成膜条件下,在TixOs(?)上制备涂层,分别吸附 P20、(Glu)6-P20、(Glu)6-RGD、(Glu)6-P20-RGD 四种多肽。通过 SEM观察TixOs(?)-HA-多肽及TixOs(?)-HA的表面形态,XPS进行试件表面组成分析,证明多肽成功附在TixOS-HA上。通过多肽的动态释放实验、TixOs(?)-HA-多肽作用MC3T3-E1后的Hoechst染色观察细胞粘附形态、CCK-8测试细胞粘附与增殖率、试剂盒检测ALP活性及OCN水平,再一次验证出(Glu)6具有骨靶向性,起到在TiXos(?)-HA上缓释功能肽的作用;RGD有效促进TixOs(?)-HA-肽对MC3T3-E1的粘附与增殖,提高了 TixOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD促小鼠成骨效率;P20可显著提高TixOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD对MC3T3-E1的促成骨分化效能。通过对成骨相关基因的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting(WB)实验,探讨TisOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD的促成骨机制。研究表明,TxOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD相比于TixOs(?)促进了 MC3T3-E1的成骨活性,可能通过激活前成骨细胞的Wnt/β-catenin信号转导通路,从而促进成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、CollagenI、BMP2和BMP7等)的表达,进而促进骨的再生。本研究构建了新型复合种植体材料TixOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD。通过PLD技术在TixOs(?)表面沉积了羟基磷灰石(HA)涂层,其具有结晶度高、组织致密、与基底结合良好及生物相容性高等特性,改善了TixOs(?)的生物活性。然后,通过短肽合成技术将(Glu)6、P20和RGD三种短肽连接成一条具有新颖功能的智能生物信号肽链,并将其以非共价键的形式结合在TixOs(?)-HA上,(Glu)6-P20-RGD多肽具有骨靶向性缓释。TixOs(?)-HA-(Glu)6-P20-RGD协同作用,有促细胞粘附及增殖、促骨分化的生物活性。进一步,探讨了其促成骨机制,发现其可能与前成骨细胞的Wnt/β-catenin信号转导通路的激活有关。本研究为种植体性能的进一步改进及临床应用提供了前期支持及理论依据。