星形胶质细胞是大脑中枢神经系统中分布最广泛的一类细胞,也是胶质细胞中体积最大的一种细胞,数量占胶质细胞的20%-40%左右。星形胶质细胞在许多如帕金森病、抑郁症等中枢神经系统疾病中都起到重要的作用。它具有包括形成内皮细胞的生化支持血脑屏障,维持细胞外离子平衡,以及在创伤性损伤后大脑和脊髓的修复和瘢痕形成过程中的作用等功能。同时,它在为神经组织提供营养和再生修复方面也起到至关重要的作用。多巴胺生理作用由五种不同但是紧密相关的G蛋白偶联受体(GPCR,G protein coupled receptor)介导。其中D2受体对于学习与记忆至关重要。D2受体是大多数抗精神病药物的主要受体,它与GPCR的Gi亚型偶联。与大多数GPCR受体一致,D2受体激活后可通过经典途径与G蛋白相互作用后激活下游信号,也可通过非经典通路,与支架蛋白β-arrestins相互作用后激活下游信号,且不依赖于G蛋白通路。目前大量临床药物通过激动Drd2来发挥治疗神经精神类疾病的作用,其重要性也因此进一步扩大。目前神经营养因子在神经精神类疾病中的重要性正逐渐为人所认知,它是一类生物分子,支持发育中及成熟的神经元的生长、存活以及分化。神经营养因子还可以促进中枢神经系统和周围神经系统中神经元的初始生长和发育,它们可以在试管和动物模型中再生受损的神经元。目前在中枢神经系统中起到较为关键作用的主要有脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,FGF-2)等。其中如BDNF、GDNF等神经营养因子在抑郁症中的重要作用已有许多文献报道,而神经营养因子假说也已成为抑郁症病因的五种假说之一。同时,在阿尔玆海默症(Alzheimer’s disease,AD)中,BDNF也可下调异常的Aβ累积从而缓解AD进程,可见其神经保护作用在神经精神类疾病中的重要性。课题组前期研究发现,在对小鼠进行缓慢轻度应激(Chronic Mild Stress,CMS)造模后,各组神经营养因子的mRNA表达均下降,而β-arrestin-/-小鼠在给予氟西汀进行治疗后,取消了氟西汀对神经营养因子的调节作用,且在CMS造模后,野生型小鼠给予β-arrestin2偏爱型DRD2激动剂UNC9995以及抗抑郁药物氟西汀,行为学检测小鼠的强迫游泳不动时间(Forced Swim Test,FST)、社交趋避时间(Social interaction test,SI)、新奇摄食时间(Novelty-suppressed feeding test,NST)、悬尾时间(Tail suspension Test,TST)均有所改善,提β-arrestin2非经典途径可能在激活DRD2后对营养因子的作用中起到一定作用。目前尚无研究报道Drd2下游的G蛋白经典通路和β-arrestin2非经典通路对星形胶质细胞神经营养因子的生成有何调节作用。本文通过离体培养星形胶质细胞研究不同的非选择性DRD2激动剂对不同的神经营养因子的调节作用;通过分别阻断G蛋白通路和β-arrestin2通路探究激活DRD2对星形胶质细胞营养因子释放的调节作用是否有通路选择性并探究具体可能的调节机制。研究结果显示:不同的DRD2激动剂ly171555、Quinelorane、Bromocriptine均能浓度梯度提高BDNF、GDNF和NGF的水平,降低VEGF的水平;进一步研究阐明,激活DRD2对神经营养因子的作用既依赖于G蛋白经典通路,也依赖于β-arrestin2非经典通路,二者共同对神经营养因子产生调节作用。本课题揭示了D2受体下游经典G蛋白通路与非经典β-arrestin2通路在对于星形胶质细胞营养因子生成过程中的作用,为后续选择靶向性及偏爱性DRD2激动剂治疗神经精神类疾病提供新思路及实验依据。目的:阐明Drd2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子生成的调节作用及其机制方法:(1)原代星形胶质细胞分别给予 ly171555(40 μM)、Quinelorane(100 μM)、Bromocriptine(100 μM)孵育,免疫印迹(western blot、WB)检测BDNF、GDNF、NGF、VEGF的蛋白表达水平;(2)实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法检测不同浓度的DRD2激动剂孵育作用下,BDNF、GDNF、NGF、VEGF的mRNA水平;(3)对原代星形胶质细胞转染Drd2 siRNA后,给予ly171555(或Quinelorane、Bromocriptine)孵育,WB 法或酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Elisa)检测BDNF、GDNF、NGF的蛋白水平,检测ly171555(或Quinelorane、Bromocriptine)对于神经营养因子的作用是否依赖于Drd2,筛选出在不同的Drd2完全激动剂作用下,具有一致性变化的营养因子进行深入研究;(4)原代星形胶质细胞给予百日咳毒素PTX(100 ng/ml)3 h,抑制G蛋白通路,给予ly171555进行孵育,检测神经营养因子的水平的变化是否依赖于G蛋白通路。(5)使用β-arrestin2-/-原代星形胶质细胞或对原代星形胶质细胞转染β-arrestin2 siRNA后,给予ly171555进行孵育,western blot法或elisa法检测神经营养因子(BDNF、GDNF、NGF)的水平的变化是否依赖于β-arrestin2通路。(6)对β-arrestin2-/-原代星形胶质细胞或对原代星形胶质细胞转染β-arrestin2 siRNA后,给予百日咳毒素PTX(100 ng/ml)3 h,抑制G蛋白通路,给予ly171555(40μM)进行孵育,验证神经营养因子的水平的变化是否被取消;(7)对于经典G蛋白通路,给予ly171555(40 μM)进行孵育后,western blot检测下游p-CaMKII、CaMKII及p-CREB、CREB等蛋白水平;(8)对于非经典βrrestini通路,给予1y171555(40 40M)进行孵育后,western blot检测下游p-ERK1/2,ERK1/2/CREB等蛋白表达水平。结果:(1)不同的DRD2激动剂均能调节星形胶质细胞中BDNDNGDNDNNGF、VEGF的蛋白表达。不同的DRD2激动剂喹吡罗(1y171555)(4040M)N喹诺雷(Quineloronen(100 μM)、溴隐亭(Bromocriptinen(100 μM)均能上调培养的小鼠原代星形胶质细胞中BDNF、GDNF、NGF的蛋白水平(<0.05),下调VEGF的蛋白水平(<0.05)。(2)不同的DRD2激动剂均能调节星形胶质细胞中BDNDNGDNDNNGFGVEGF的mRNA水平。浓度的DRD2激动剂1y171555(10 μM、20 μM、40μM)、Quinelorone(10μM、50 μ100μM)、Bromocriptine(10μM、50μM、100μM)均能浓度梯度上调BDNF、GDNF、NGF的mRNA水平<0.05),下调VEGF的mRMA水平(p<0.05)。)。(3)DRD2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子的调节作用依赖于DRD2。对星形胶质细胞转染Drd2 siRNA,干扰星形胶质细胞Drd2的表达后,DRD2激动剂1y171555(40μM)对神经营养因子BDNDNGDNDNNGF生成的调节作用被取消。(4)DRD2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子的调节作用不完全依赖于G蛋白经典通路。使用百日咳毒素(PTX)(100 ng/m/mlh预处理原代星形胶质细胞再给予DRD2激动剂y171555(40 μM)刺激12 h后,检测到星形胶质细胞神经营养因子BDNF、GDNF、NGF的上调作用依旧存在(p<0<05)。提示PTX阻断了G蛋G通路后,DRD2的激活对于星形胶质细胞神经营养因子的调节作用依旧存在,提示DRD2的激活对于星形胶质细胞神经营养因子的调节作用不完全依赖于G于G经典通路。(5)DRD2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子的调节作用不完全依赖于β-arrestinin经典通路通通。通过培养β-arrestin2-/-小鼠的原代星形胶质细胞或对星形胶质细胞转染β-βrrestin2 siRNA后,给予Drd2激动剂1y171555(40μM)刺激12h后,检测到星形胶质细胞神经营养因子BDNF、GDNF、NGF的上调作用依旧存在(p<0.05)。表明在敲除β-arrestin2,阻断了 β-arrestin2非经典通路后,DRD2的激活对于星形胶质细胞神经营养因子的调节作用依旧存在,提示DRD2的激活对于星形胶质细胞神经营养因子的调节作用不完全依赖于β-arrestin2非经典通路。(6)DRD2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子的调节作用共同依赖于G蛋白经典通路和β-arrestin2非经典通路。通过培养β-arrestin2-/-小鼠的原代星形胶质细胞或对星形胶质细胞转染β-arrestin2 siRNA后,使用PTX(100 ng/ml)预处理3h后给予1y171555(40 μM)孵育12h,WB检测到Drd2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子BDNF、GDNF、NGF的调节作用被取消,提示DRD2激动剂对星形胶质细胞神经营养因子的调节作用共同依赖于G蛋白经典通路和β-arrestin2非经典通路。(7)DRD2激动剂通过上调星形胶质细胞p-CaMKII的水平从而调节p-CREB的水平来提高营养因子的基因表达。通过培养β-arrestin2-/-小鼠的原代星形胶质细胞或对星形胶质细胞转染β-arrestin2 siRNA后,给予1y171555(40 uM)孵育12 h后,WB检测G蛋白通路下游CaMKII、p-CaMKII及营养因子上游p-CREB的蛋白水平均升高(p<0.05)。(8)DRD2激动剂通过上调星形胶质细胞p-ERK1/2从而调节p-CREB的水平来诱导营养因子的表达增加。使用百日咳毒素(PTX)(100 ng/ml)3h预处理原代星形胶质细胞再给予DRD2激动剂1y171555(40 μM)刺激12 h后,WB检测β-arrestin2下游信号ERK1/2、p-ERK1/2及营养因子上游p-CREB的蛋白水平均升高(p<0.05)。结论:(1)激动DRD2可以调节星形胶质细胞神经营养因子的水平。(2)激动DRD2同时通过G蛋白经典通路及β-arrestin2非经典通路调节p-CREB的水平来诱导营养因子的表达变化。本工作的主要创新之处:(1)发现星形胶质细胞中DRD2的激活对神经营养因子生成的具体调节作用。(2)阐明了激动DRD2在调节星形胶质细胞营养因子的作用中,DRD2下游G蛋白/β-arrestin2信号通路作用机制。拓展了DRD2激动剂在星形胶质细胞上的作用,为临床上DRD2激动剂的应用与功能的研发提供新思路。