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背景结核病是危害全球健康的重大公共卫生问题，虽随着短程督导化疗方案的普遍实施，结核病疫情已经有所控制，但当前结核病控制仍面临着耐多药，合并HIV感染及流动人口等问题带来的巨大挑战。非结核分枝杆菌是指结核与麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌，是一类在自然界中广为分布的环境病原体。其可通过多种途径感染易感人群引起局部或全身病灶，甚至导致死亡。国内外越来越多的研究表明非结核分枝杆菌感染及其相关疾病的流行已呈现出上升的趋势。抗酸染色涂片镜检法简单、快速，且是发现肺结核传染源的有效方法。在结核病高发地区，其已成为结核病实验室诊断的主要指标。但其只能证明抗酸杆菌的存在，不能区分结核与非结核分枝杆菌，在全球非结核分枝杆菌感染上升的背景下这使越来越多的涂阳病人有可能被误诊而接受不必要或不适当的抗结核治疗。依靠培养的传统菌种鉴定方法虽能达到区分两者的目的，但在发展中国家的多数基层实验室尚无技术条件开展培养实验，上级分枝杆菌实验室虽能开展，但其繁琐又费时，远不能满足临床诊疗的需要。目的了解NTM的流行状况和流行病学特征，初步评价IS6110荧光定量PCR法快速鉴定阳性痰涂片中的结核分枝杆菌的临床应用价值，同时对抗酸染色阳性痰涂片刮削物扩增分枝杆菌利福平耐药基因（rpoB基因）进行初步探索。第一部分广州市越秀、海珠区非结核分枝杆菌流行状况分析一、研究对象及方法选取2010年-2012年于越秀、海珠区两个结核病防治所就诊的可疑肺结核患者，收集其痰分枝杆菌培养等实验室资料。对于在研究期间有多次阳性培养和菌菌种鉴定的同一病例只按1例计算，且选择在时间上靠近研究起点的实验室结果纳入统计分析。每个病例均在清晨留取深部痰标本进行分枝杆菌液体培养检测，培养分离的菌株通过PNB生长抑制试验进行MTC与NTM初步鉴别，NTM分离株按照中国防痨协会操作规程通过分枝杆菌的培养特征及一系列生化测试鉴定其菌种。二、结果1、可疑肺结核患者痰标本中MTC与NTM的分离率分别为80.9%、19.1%。2010-2012各年度的NTM分离率分别为17.6%、17.1%、21.2%。2、NTM分离者的男女比例为1.56：1，60岁及以上老年病例仅占26%，45-59岁、15-29岁年龄段为NTM分离高峰。3、NTM菌种中快生长型占50.6%，慢生长型占49.4%。龟脓肿和鸟胞内复合群为主要的分离菌种，分别占40.5%和24.1%。第二部分痰涂片抗酸染色阳性患者分枝杆菌的分离情况分析一、研究对象及方法选取2012年~2013年于越秀、海珠区两个结核病防治所诊治的痰AFB涂片阳性且同期培养阳性的病例共331例。其中男性238例，女性93例(M/F=2.56)；年龄范围15~87岁之间，平均39岁；初治225例，复治106例。所有病例均于清晨留取深部痰标本用于涂片抗酸染色及分枝杆菌分离培养和鉴定。二、结果1、痰涂片AFB阳性患者中MTC和NTM的分离率分别为81%和19%。2012年NTM分离率为14.1%，2013年为25.2%。2、初治和复治涂阳患者NTM分离率分别为12%和34%。3、MTC组涂片阳性等级≤1+占55.97%，>1+占44.03%。NTM组涂片阳性等级≤1+占82.54%，>1+占17.46%。第三部分IS6110-荧光定量PCR法快速鉴定抗酸染色阳性涂片中的结核分枝杆菌一、研究对象及方法331例同期培养阳性的抗酸染色阳性痰涂片来自2012年-2013年于越秀、海珠区结核病防治所就诊的患者。其中阳性等级为1-9条/300视野的涂片25例，1+的涂片177例，2+涂片66例，3+涂片30例，4+涂片33例。根据其同期培养分群鉴定结果分为两组，其中MTC组268例，NTM组63例。应用结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂对所有痰涂片刮削物分枝杆菌DNA行荧光定量PCR检测。二、结果1、荧光定量PCR法初步鉴定阳性涂片中分枝杆菌菌群的灵敏度和特异度分别为69.40%、76.19%。2、荧光定量PCR法在鉴定抗酸染色涂片阳性标本中的分枝杆菌菌群与培养法一致程度较差（kappa=0.324）。3、MTC组各阳性等级涂片的阳性检出率分别为26.67%、63.70%、68.97%、92.86%、93.75%。4、FQ-PCR检测的靶基因拷贝数和涂片阳性等级存在正相关（r=0.563）。第四部分抗酸染色阳性痰涂片刮削物扩增分枝杆菌rpoB基因的初步探索一、研究对象及方法18株临床分离结核分枝杆菌来自广州市胸科医院“广州地区分枝杆菌菌株库”，80张抗酸染色阳性(3+～4+)痰涂片来自广州市越秀区结核病防治所，涂片样本来自经分枝杆菌培养鉴定证实的肺结核患者。设计两对引物，以菌株、痰涂片刮削物中提取的基因组DNA为模板扩增rpoB基因，PCR产物经凝胶电泳检测。二、结果1、两对引物对18例临床分离株基因组DNA进行扩增，均能见到明亮目的条带，扩增产物经测序证实为rpoB基因。2、痰涂片刮削物DNA经不同模板量、不同退火温度，两组引物分别行普通PCR、Touchdown PCR、巢式PCR、二次PCR扩增rpoB基因均未有目的条带。荧光定量PCR检测两种不同方法提取的痰涂片DNA拷贝数分别为102-103copies/ul和104-105copies/ul。3、菌株基因组DNA经100-107一系列倍数稀释后，两对引物扩增rpoB基因分别在104、103以下的稀释倍数能观察到明亮目的条带，对应的荧光定量PCR检测拷贝数分别为106copies/ul、107copies/ul。结论1、可疑肺结核患者痰标本中NTM分离率19.1%。2、NTM感染人群以中青年为主。3、NTM以快速生长分枝杆菌较多见。4、涂阳患者NTM分离率为19%,2013年涂阳患者NTM分离率明显高于2012年。5、复治涂阳病人比初治者更易分离到NTM。6、非结核分枝杆菌痰涂片阳性标本以1+以下多见。7、IS6110-荧光定量PCR法检测到的结核分枝杆菌基因拷贝数与涂片阳性等级成正相关。8、IS6110-荧光定量PCR法可作为阳性等级3+以上痰涂片中分枝杆菌快速初步鉴定的较好方法。9、阳性痰涂片刮取物中提取的DNA量不足是rpoB基因未能成功扩增的主要原因。