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茶是世界三大无酒精饮料之一,富含茶多酚、生物碱、茶多糖、茶氨酸等活性物质。作为茶叶中的重要生物碱,咖啡碱因为具有兴奋神经、提神利尿等医学功效而尤其受到人们的广泛关注。N-甲基转移酶（N-methyltransferase,NMT）是参与咖啡碱生物合成的关键酶类,克隆NMT基因启动子及研究其功能,并分析与其相互作用的转录调控因子,对进一步揭示茶叶咖啡碱代谢调控,具有积极的意义和作用。本研究以英红9号茶树为材料,以克隆的重要功能基因yhNMT1为对象,利用hiTAIL-PCR法克隆yhNMT1基因启动子。通过生物信息学分析其顺式作用元件,借助对烟草植物转基因的瞬时表达和稳定表达技术,测定了该启动子的功能特性及环境胁迫因子对其功能的影响。利用酵母单杂交技术经文库构建与筛选克隆获得yhNMT1基因启动子对应的候选转录因子基因,并对克隆的转录因子亚细胞定位进行了研究。获得的结果主要如下:（1）yhNMT1基因启动子克隆及生物信息学分析克隆的yhNMT1基因启动子长767 bp,命名为PNMT1,序列经Plant CARE和PLACE等在线软件分析,预测的转录起始位点TSS位于翻译起始位点上游63 bp的碱基A处。PNMT1含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件,并具有多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,如脱落酸响应元件ABRE,厌氧诱导响应元件ARE,茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif,热应答元件HSE,乙烯应答元件ERE,水杨酸响应元件TCA-element,光应答元件如AE-box等。（2）yhNMT1启动子在烟草叶片中的的瞬时表达分析根据启动子作用元件位置,以5’递减的不同长度的yhNMT1启动子替换pBI121载体中的CaMV35S启动子,构建出与GUS基因融合的系列载体pA、pB、pC、pD。对构建的载体利用烟草叶片进行GUS瞬时表达分析,组织GUS化学染色结果表明,4个载体转化的叶片中随插入启动子长度的增加而GUS染色加深,说明不同长度的yhNMT1基因启动子均具驱动GUS基因表达功能,且长度越长驱动能力越强。（3）yhNMT1启动子在转基因烟草中的稳定表达分析以含克隆全长yhNMT1启动子的载体pA对烟草进行农杆菌介导的转基因,对得到的转基因烟草进行GUS组织化学染色分析,结果表明在转基因烟草中yhNMT1启动子驱动GUS基因表达无组织特异性。定量PCR分析表明启动子驱动能力具有组织差异性,转基因烟草中GUS基因表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,叶片中GUS基因表达量在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。（4）利用酵母单杂交技术克隆与yhNMT1启动子互作的转录因子根据酵母单杂交技术,将yhNMT1基因启动子构建进诱饵载体,经转化酵母Y1H细胞及筛选鉴定,获得抗AbA的新酵母菌株Y1H（PNMT1-AbAi）。将茶叶cDNA和pGADT7-Rec载体共转化Y1H（PNMT1-AbAi）菌株,成功构建出酵母单杂交文库,其容量达2.7×106 cfu。经对文库筛选成功获得4个与启动子PNMT1互作的转录因子,分别命名为yhTF1、yhTF2、yhTF3、yhTF4。对克隆的转录因子预测分析表明,yhTF1属于NAC家族转录因子,yhTF2属于HD-Zip家族转录因子,yhTF3与NAC结构域蛋白具有约45%同源性,推测其可能参与相关非生物胁迫,yhTF4含有未知功能的DUF1685蛋白结构域并可能参与植物光反应系统。（5）转录因子亚细胞定位据PSORT在线工具进行亚细胞定位预测分析,四个转录因子蛋白定位于细胞核的概率分别是73.9%、91.3%、65.2%、26.1%。将4个转录因子基因分别构建进瞬时表达载体pGreen-C18-GFP并借助烟草叶下表皮细胞进行亚细胞定位,结果表明:yhTF1和yhTF3蛋白定位于细胞核,yhTF2蛋白定位于细胞核和细胞质,yhTF4蛋白定位于细胞质。