弯曲菌(Campylobacter)是一种重要的食源性人兽共患病原菌,是全球范围内引起人胃肠道感染的最常见的病原菌之一,特定血清型空肠弯曲菌引起的肠炎是诱发格林-巴利综合症(GBS)的重要前驱感染因子。弯曲菌作为许多畜禽的寄生菌在自然界广泛存在,人常因食入被弯曲菌污染的食品等而感染。此外,由于弯曲菌耐药性的不断出现,食品安全和食源性疾病的问题已日益突出,成为公共卫生关注的新焦点。本研究的目的是:(1)对医院腹泻人群、牛群弯曲菌的感染流行状况进行初步调查研究;(2)应用国标方法鉴定分离株的生化特性,并应用2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的琼脂扩散法进行耐药分析;(3)采用PCR-RFLP亚分型方法追溯不同来源的空肠弯曲菌间的相互关系。一、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行病学调查在2005年7月-2006年12月间,采集扬州市区三所医院门诊部和住院部的腹泻人群的粪便样品2,962份和江苏省10个奶牛场的产奶牛、育成牛、饲养环境样品1,531份,以国标方法为参照,采用增菌培养、选择性培养和多重PCR鉴定方法对上述样品进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定。结果显示,在2,962份医院粪便样品中,143份空肠弯曲菌阳性,平均阳性率4.83%,10份结肠弯曲菌阳性,平均阳性率0.34%。统计分析表明,不同医院间感染率差异不显著(p>0.05),门诊部感染率极显著高于住院部(p<0.01),7岁以下幼儿感染率极显著高于其它年龄段人群(p<0.01),6月-8月感染率显著高于12月-2月和3月-5月份的感染率(p<0.05)。在1,531份牛场样品中,119份空肠弯曲菌阳性,平均阳性率7.77%;3份结肠弯曲菌阳性,平均阳性率0.20%;空肠弯曲菌、结肠弯曲菌阳性率最高分别为30.91%、3.57%。在三类样品中,产奶牛空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的平均阳性率分别为5.02%、0.32%,育成牛空肠弯曲菌的平均阳性率为8.70%、未检出结肠弯曲菌,环境样品空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的平均阳性率分别为10.28%、0.18%。上述结果显示,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌在腹泻人群和奶牛群体的流行呈现多样化和复杂化,牛群的感染率高于人群,应加强牛群弯曲菌的控制,将有助于控制弯曲菌的感染和传播。二、人源和牛源弯曲菌分离株的生化特性与耐药性分析采用国标方法和2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的琼脂扩散法对93株人源空肠弯曲菌、35株牛源空肠弯曲菌,以及13株结肠弯曲菌的生化特性和耐药性进行了研究。生化实验结果显示,128株空肠弯曲菌和13株结肠弯曲菌的氧化酶实验均呈阳性,128株空肠弯曲菌的马尿酸钠水解实验呈阳性,13株结肠弯曲菌的马尿酸钠水解实验呈阴性,结果表明所有的分离株均为弯曲菌,且本研究所分离的空肠弯曲菌在实验室培养条件下没有失去分解马尿酸盐的能力。药敏实验结果显示,93株人源空肠弯曲菌对8大类21种抗生素高度敏感的是:庆大霉素91.40%、阿齐红霉素89.25%、红霉素88.46%、阿莫西林87.10%、链霉素83.87%、头孢噻肟81.72%、卡那霉素81.72%,高度耐药的是:头孢哌酮100%、复方新诺明100%、头孢拉定97.85%、头孢克罗93.55%、环丙沙星91.40%、萘啶酸91.40%、左旋氧氟沙星88.17%、土霉素87.50%。耐药菌株的耐药谱主要集中在9耐至14耐,达81.71%,两医院分离株多重耐药性无显著性差异(p>0.05),不同诊区分离株的多重耐药性间存在显著性差异(p<0.05)。35株牛源空肠弯曲菌对抗生素高度敏感的是:阿莫西林100%、阿齐红霉100%、链霉素97.14%、庆大霉素94.29%、红霉素91.43%、头孢噻肟82.86%、克林霉素82.86%;高度耐药的是:头孢哌酮100%、恩诺沙星100%、环丙沙星97.14%、复方新诺明97.14%、左旋氧氟沙星94.29%、萘啶酸94.29%、头孢拉定94.29%、诺氟沙星91.43%、头孢克罗88.57%。菌株耐药谱显示,35株分离株的耐药主要集中在9耐到12耐,占88.57%,产奶牛分离株的多重耐药性较其它来源的分离株的耐药性更严重。13株结肠弯曲菌对临床常用的抗生素高度敏感的是:头孢噻肟100.00%、阿莫西林92.31%、红霉素92.31%、阿齐红霉素92.31%、克林霉素84.62%,高度耐药的是:头孢拉定100%、头孢哌酮100%、诺氟沙星100%、恩诺沙星100%、环丙沙星100%、左旋氧氟沙星100%、萘定酮酸100%、复方新诺明100%、四环素100%、头孢克罗92.31%、强力霉素92.31%、土霉素88.89%。耐药菌株的耐药谱主要分布在16耐、15耐、13耐和11耐,占76.91%。与空肠弯曲菌的耐药谱相比,结肠弯曲菌的多重耐药性较为严重。人源和牛源的分离株对头孢菌素类、喹诺酮类和磺胺类抗生素均产生了很强的耐药性,此外,人源分离株还对四环素类抗生素产生了较强的耐药性,而且多重耐药的现象很严重,92.2%的菌株在9耐以上,更值得人们注意的是,通过对临床用药的分析,弯曲菌的耐药性并非是完全在治疗弯曲菌病的过程中产生的,主要是在用抗生素防止和治疗其它各种感染的过程中产生的,弯曲菌的耐药性多属于被动耐药。因此在抗生素的使用过程中,要注意交叉用药,防止多重耐药菌株的产生。同时,还必须严格控制各种耐药微生物到处传播,以防多重耐药性病原菌的交叉传递。我国人源和牛源空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的耐药状况呈现多样化和复杂化,必须加强各地弯曲菌耐药性和抗生素使用情况的监测,及时调整用药方案和公共卫生策略。三、空肠弯曲菌FlaA基因RFLP分子亚分型方法的建立与应用根据文献合成引物,PCR扩增目的片段,限制性内切酶DdeⅠ进行酶切,建立PCR-RFLP亚分型方法,重复性实验表明该方法具有良好的分型能力,是一种快速、简便、辨别力强、重复性好的分子亚分型方法,可作为研究空肠弯曲菌来源和传播途径的有力工具。应用该分型方法对329株不同来源的空肠弯曲菌进行分析,277株菌株得到了有效分型,可分型率为84.19%。通过对获得的图谱进行比对,将菌株分成了20个不同的RFLP谱型,优势谱型有2、5、6、7、9、11、12、15、16、18、20,占82.67%。其中,170株鸡群分离的空肠弯曲菌被分布在20个不同的谱型中,70株人源分离的菌株被分为19个不同的基因谱型,25株牛源空肠弯曲菌被分为13个不同的谱型,12株市场分离的菌株被分为6个基因型别。在人源的9个主要型别中,有8个分别与其它三种来源菌株的主要型别相互重叠。人源分离株的型别与鸡源、牛源以及市场禽肉分离株的型别呈交叉分布,表明牛、鸡是人类感染空肠弯曲菌的主要传染源之一,为研究空肠弯曲菌的种内差异和致病力差异奠定了基础。上述结果显示本文建立的空肠弯曲菌PCR-RFLP亚分型方法,对空肠弯曲菌感染源追踪有重要应用价值。