骨骼遗传疾病(Skeletal genetic diseases)是一组以全身骨骼生长发育障碍为特征的遗传性骨骼系统疾病。临床上主要表现为各类骨骼组织生长、发育异常,如身材矮小、头颅四肢畸形、脊柱侧弯、骨密度异常等。目前,按照2015年修订的遗传性骨骼疾病国际分类标准,依其已知的分子遗传学基础、病因学和表型,被划分为436种42大类。该类疾病常导致各类出生缺陷,人群总发病率大约1/1500,严重危害国民的身体健康。目前,随着研究的深入,许多骨骼遗传性疾病的致病基因已被鉴定发现,但仍有部分遗传性骨骼疾病的致病基因仍不清楚,有约一半的骨骼遗传疾病的致病机制尚未完全阐明。因此,阐明骨骼发育机制及骨骼遗传性疾病的致病分子机制,将为人类骨骼疾病的早期诊断及有效防治提供更多的理论依据。遗传病患者是研究这些遗传性骨骼疾病最直接的研究对象,但这些遗传资源较难获取,数量相对较少,且考虑到社会伦理和道德的制约,许多的科学实验中不可能利用遗传病患者自身作为实验对象。因此,遗传背景稳定的模式动物是开展遗传病研究的理想对象。斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物,在人类疾病模型中已广泛应用。与鸡、小鼠等传统动物模型相比,斑马鱼具有个体小、繁殖周期短,繁殖力强,体外受精发育,胚胎透明等特点,斑马鱼基因组与人类基因组相似性高达87%。斑马鱼的骨骼尤其是头颅及脊柱与哺乳动物结构组成相似,在骨骼发育过程中的相关信号通路和调控机制高度保守。因此,斑马鱼已成为研究骨骼发育和相关疾病的理想动物模型。我们的研究选取斑马鱼为实验模式动物,利用ENU大规模诱变筛选及CRISPR/Cas9基因敲除技术,聚焦于三种不同的骨骼遗传性疾病开展研究。(1)先天性脊柱侧凸(Congenital scoliosis,CS)是由于胚胎期椎体发育异常导致的脊柱畸形,其具体的遗传病因和潜在机制仍不清楚。通过大规模的诱变筛选可发现引起斑马鱼CS的新基因并进一步阐明其发病机制。(2)软骨毛发发育不良(Cartilage-hair hypoplasia,CHH)是一种常染色体隐性遗传病,以身材矮小、免疫缺陷和毛发稀疏为特征,是由于长链非编码RNA RMRP突变导致的。由于目前还没有可以存活的CHH动物模型,CHH导致骨骼发育异常的致病机制尚未阐明。通过CRISPR/Cas9技术建立rmrp敲除斑马鱼模型来模拟CHH疾病,可进一步研究其发病机制。(3)CATSHL综合症是主要表现为屈曲指,身材高大和听力丧失等临床症状的一种常染色体显性或隐性遗传综合征,是由于FGFR3的杂合或纯合突变导致的。CATSHL综合症导致骨骼发育异常及听力丧失等表型的细胞分子机制尚未完全阐明。通过CRISPR/Cas9技术建立fgfr3敲除斑马鱼模型来模拟CATSHL综合症,可进一步研究其发病机制。研究方法:第一部分:斑马鱼脊柱畸形突变体的筛选及致病基因功能研究1.斑马鱼ENU诱导的大规模遗传筛选:繁殖ENU处理后的F3代胚胎,体视显微镜观察大体表型,钙黄绿素活体染色观察椎体矿化。2.Smt突变体的定位克隆:构建具有单链片段长度多态性群组的斑马鱼品系,通过分离群体分析法(BSA)定位克隆突变基因,注射mRNA进行回救实验。3.整胚原位杂交检测dstyk基因表达模式,CRISPR/Cas9敲除dstyk基因验证突变表型。4.利用标记细胞膜的转基因鱼系Tg(β-actin:ras-GFP);标记脊索细胞的转基因鱼系Tg(col2a1a:EGFP)分析突变体脊索表型。5.细胞器Tracker活体染色,免疫荧光,整胚原位杂交分析突变体脊索发育异常的原因。6.透射电镜检测突变体脊索和脊索鞘的超微结构变化。7.利用转基因鱼系Tg(col2a1a:EGFP);Tg(osterix:mCherry)以及钙黄绿素染色分析突变体脊柱畸形原因。8.免疫荧光及转基因鱼系检测DSTYK的亚细胞定位,DSTYK siRNA的敲降实验分析对溶酶体形成的影响。9.免疫荧光,WB检测分析Dstyk敲除抑制溶酶体及脊索液泡生成的分子机制,体外细胞层面及斑马鱼体内层面进行回救实验验证表型变化。第二部分:软骨毛发发育不良的斑马鱼模型构建及发病机制的研究1.利用多序列比对比较斑马鱼rmrp的转录区和启动子区序列的保守性。整胚原位杂交分析斑马鱼rmrp的表达模式。2.利用CRISPR-Cas9技术敲除斑马鱼rmrp,并分析其大体表型。3.阿尔新蓝染色,软骨细胞标记的转基因鱼系Tg(col2a1a:EGFP)及原位杂交分析rmrp突变体的软骨发育表型。4.利用茜素红活体染色及标记成骨细胞的转基因鱼系Tg(osterix:EGFP)分析rmrp突变体的成骨发育表型。5.利用转基因鱼系及HE染色等分析rmrp突变体肠道和头颅血管的发育。6.EdU和TUNEL标记实验分析rmrp突变体的细胞增殖和凋亡的变化。7.WB,定量PCR,免疫荧光,原位杂交等分析rmrp突变表型形成的机制,并进行回救实验观察能否缓解突变表型。第三部分:CATSHL综合征的斑马鱼模型构建及致病机制研究1.利用多序列比对比较斑马鱼fgfr3的编码序列和氨基酸序列的保守性。整胚原位杂交分析斑马鱼fgfr3的表达模式。2.利用CRISPR-Cas9技术敲除斑马鱼fgfr3,分析其大体表型,X线、micro-CT及阿尔新蓝和茜素红全骨架染色分析其骨骼表型。3.利用茜素红活体染色及标记成骨细胞的转基因鱼系Tg(osterix:EGFP)分析fgfr3突变体在不同时间点头颅成骨发育,脊柱发育及鱼鳞片发育的表型。4.利用标记软骨细胞的转基因鱼系Tg(col2a1a:EGFP)分析fgfr3突变体发育不同时间的软骨发育的表型,组织学染色分析fgfr3突变体软骨生长板表型。5.通过EdU细胞标记实验,WB,原位杂交,转基因鱼系等检测分析fgfr3突变体导致各种异常表型的细胞和分子机制。实验结果:第一部分:斑马鱼脊柱畸形突变体的筛选及致病基因功能研究1.经ENU筛选得到一个体节缩短(smt)的突变体,smt突变体有严重的脊柱侧凸和后凸畸形。2.致病基因的定位克隆及回救实验发现smt突变体的表型是由dstyk突变导致的。3.Dstyk在胚胎发育早期广泛分布表达,此后在脊索动态表达。CRISPR/Cas9敲除dstyk基因同样发现有体节缩短及脊柱畸形的表型。4.Dstyk基因突变导致脊索细胞液泡膨胀不完全,导致脊索发育异常。5.Dstyk基因突变导致囊泡转运异常引起脊索液泡生成障碍,脊索中shh、cmn、col8a1a、col9a1b、col11a2表达降低,脊索功能异常。6.超微结构显示dstyk突变体的脊索细胞液泡形成障碍,脊索鞘排列及结构紊乱。7.Dstyk突变导致中轴骨分节异常,脊椎形成缺陷,最终导致脊柱畸形。8.体内及体外研究表明,DSTYK定位在晚期内吞体/溶酶体,参与哺乳动物细胞溶酶体的形成。9.Dstyk敲除激活mTORC1信号通路,抑制TFEB的磷酸化,从而抑制转录因子TFEB的入核,抑制溶酶体和脊索液泡的形成。mTORC1抑制剂Torin1处理可部分回救dstyk敲除后TFEB的入核障碍,部分回救溶酶体生成障碍。Torin1处理dstyk突变体可部分回救脊柱畸形的表型。第二部分:软骨毛发发育不良的斑马鱼模型构建及发病机制的研究1.对人,小鼠和斑马鱼RMRP的转录区和启动子区多序列比对显示rmrp在多种物种间高度保守。Rmrp在包括软骨在内的多种组织中表达。2.CRISPR/Cas9敲除rmrp基因导致下颌发育异常,心包膜水肿,不能形成鱼鳔,眼睛及头部变小。3.Rmrp基因敲除导致咽弓软骨发育不良,软骨发育相关的分子sox9a和col2a1a表达延迟。4.Rmrp突变体膜内成骨明显受抑制,软骨内成骨继发于软骨发育不良而发生延迟,但脊柱椎体矿化加速,矿化的椎体数量显著增加。5.Rmrp突变体肠上皮细胞数量减少,肠绒毛缺失,头颅血管发育畸形。6.Rmrp突变通过影响细胞周期相关基因的表达抑制细胞增殖,可上调凋亡相关基因的表达促进细胞凋亡。7.Rmrp突变可上调经典Wnt/β-catenin信号通路,而使用β-catenin抑制剂XAV939处理可部分缓解rmrp突变体软骨发育不良和椎体矿化增加。第三部分:CATSHL综合征的斑马鱼模型构建及致病机制研究1.对人,小鼠和斑马鱼的fgfr3编码序列和氨基酸序列多序列比对显示fgfr3在多种物种间高度保守。Fgfr3在包括软骨在内的多种组织中表达。2.CRISPR/Cas9敲除fgfr3基因导致颅面骨骼发育畸形,下颌骨和颅骨的骨化受到严重抑制,鱼鳔发育异常。3.Fgfr3突变体膜内成骨及软骨内成骨均明显受抑制,鳞片发育形成也受阻,部分听觉感觉器官发育异常。4.斑马鱼敲除fgfr3导致软骨细胞异常肥大和软骨细胞排列紊乱,破坏了咽弓的发育和模式形成,同时导致部分软骨存在软骨瘤样病变。5.斑马鱼fgfr3突变增强IHH信号,促进软骨细胞增殖。6.Fgfr3突变上调Wnt/β-catenin信号,抑制Wnt信号可部分缓解fgfr3突变所致的软骨发育异常。结论:1.Dstyk突变通过mTORC1/TFEB信号影响脊索液泡的发育,导致中轴骨分节异常及椎体形成缺陷,最终导致脊柱畸形。2.斑马鱼rmrp突变体可部分模拟软骨毛发发育不全遗传病,rmrp突变可通过上调Wnt/β-catenin信号影响软骨发育及骨矿化。3.斑马鱼fgfr3突变体可部分模拟CATSHL综合征,fgfr3突变导致软骨细胞异常肥大和软骨细胞排列紊乱,这些软骨结构异常可导致下颌骨软骨力学改变,导致颅面畸形。