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目的:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎性、系统性的全身性自身免疫性疾病,是临床常见且多发、难治疗的关节运动性疾病之一,被称为“不死的癌症”。有较高的致残率,患病2年致残率达50%,3年致残率达70%。RA的治疗时机与预后息息相关,早治疗的预后残疾远远低于晚治疗,早期诊断并及时治疗,对减少或预防随之而来的损伤是至关重要的。目前,临床上RA的血清学检测主要包括类风湿因子(Rheumatoid Factor,RF)和抗瓜氨酸蛋白抗体(Anti-cyclic citrullinated peptide antibody,ACPA)检测,但在早期或者不典型的RA患者中易出现漏诊或误诊的情况。因此,寻找灵敏度、特异度更高的新血清标志物并建立新的诊断方法成为该病诊断及治疗亟待解决的问题之一。本课题拟采用RA血清为生物样本,通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)筛选RA高特异性血清核酸适配体。利用该适配体分离提取靶蛋白,建立相应的检测方法,并初步评价其诊断价值,为该靶蛋白成为RA血清标志物提供实验依据。从而为建立新的、高效的RA诊断方法奠定实验基础。方法及结果:1.ssDNA文库与引物的设计、合成及对称PCR条件优化文库及引物的设计:ssDNA适配体序列全长为90 nt,两端为含有引物结合位点的18 nt固定序列,中间随机序列为54 nt,上下游引物分别为P1、P2。对称PCR条件优化:在PCR反应体系中,通过改变循环数(8、10、12、15、18、20)和退火温度(54℃-60℃之间)优化对称PCR反应条件。确定对称PCR扩增反应最佳循环数为12个循环,最佳退火温度为56.4℃。2.适配体库筛选以健康体检者和系统性红斑狼疮、银屑性关节炎、强直性脊柱炎患者混合血清为反筛物质,进行3轮反向SELEX。随着筛选轮次的增加,与反筛物质结合的寡核苷酸片段逐渐减少,达到除去大量非特异性寡核苷酸片段的目的;以类风湿性关节炎患者混合血清为正筛物质,进行正向SELEX筛选,随着筛选轮次及筛选压力的不断增加,亲和力较弱的寡核苷酸片段被去除,筛选至第9轮时,获得类风湿性关节炎血清特异性适配体库。3.适配体克隆和生物信息学分析将筛选得到的类风湿性关节炎血清特异性适配体库委托生工克隆测序,克隆后随机挑取30个克隆子进行测序。适配体同源性分析:利用DNAMAN V5.2.2软件进行适配体序列同源性分析,结果显示30个克隆子中存在12条重复序列,无共同保守序列。最终确定共有18条特异性适配体,分别命名为Rheumatoid Arthritis Aptamer 1-18(RA-Ap1-18)。适配体二级结构预测:利用DNAMAN V5.2.2软件进行适配体序列二级结构预测分析,结果显示18条适配体均为不同形式茎环结构,推测这种不同形式的茎环结构可能是与血清靶标物质特异性结合的结构基础。4.适配体亲和力和特异性分析采用荧光光度法分别检测适配体的亲和力和特异性。亲和力检测结果显示:解离常数Kd值均已达到nmol/L水平,其中适配体RA-Ap5、RA-Ap10、RA-Ap13、RA-Ap14、RA-Ap17、RA-Ap18显示出较高的亲和力。特异性检测结果显示:适配体RA-Ap5、RA-Ap18对正常血清、系统性红斑狼疮血清、强直性脊柱炎血清和银屑性关节炎血清均具有显著性差异(P<0.01)。根据亲和力和特异性分析结果初步确定,适配体RA-Ap5、RA-Ap18可作为类风湿性关节炎高特异性血清核酸适配体。5.靶蛋白的制备及初步鉴定用适配体-生物素-链霉亲和素磁珠方法,分离、提取得到的靶蛋白,经过SDS-PAGE法纯化得到电泳纯制品,其分子量分别约为25 KDa及25 KDa-32 KDa之间;紫外光谱扫描结果显示,在280 nm处有最大吸收峰,证明靶物质的蛋白质化学属性;适配体RA-Ap5提取的靶蛋白电泳条带单一,分子量大小在25 KDa左右,适配体RA-Ap18提取靶蛋白有两条条带,其中一条分子量大小在25 KDa左右,另一条分子量在25 KDa-32 KDa之间,说明两条适配体均可以结合25 KDa靶蛋白,提示:(1)25 KDa左右靶蛋白具有两个特异结合位点。(2)RA-Ap5具有更高的特异性,可作为靶蛋白潜在的检测试剂。6.靶蛋白荧光检测方法的建立及方法学评价适配体RA-Ap5作为类风湿性关节炎特异性适配体,根据适配体与靶蛋白结合后引起荧光强度的变化间接检测靶蛋白的含量,即靶蛋白含量∝空白对照与适配体和靶蛋白结合后荧光强度的差值,建立相应的靶蛋白荧光检测方法,并对其进行方法学评价。结果显示:靶蛋白含量与空白对照荧光强度值-适配体与靶蛋白结合后荧光强度值成线性相关(R~2=0.97),适配体最适用量为8 pmol/μl、血清用量为20μl,检测范围:19.41 ng/μl0.9,表明该方法对类风湿性关节炎具有良好的诊断价值。大样本检测评价结果显示:靶蛋白荧光检测法对类风湿性关节炎的敏感度为79.17%、特异度为88.54%、准确为83.85%,较小样本检测均有所下降;该方法诊断类风湿性关节炎AUC为0.871(0.7
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