葡萄糖淀粉酶简称糖化酶，可水解淀粉、糊精、糖原等物质，产物为葡萄糖。在工业发酵生产酒精、淀粉糖、有机酸、氨基酸等过程中，淀粉液化后的糖化酶糖化作用是必不可少的工序。因此许多生产糖化酶的企业都在努力增加糖化酶的生产量，提高经济效益。丝状真菌黑曲霉(Aspergillusniger)分泌的糖化酶热稳定性和耐酸性都很高，是我国糖化酶工业生产的主要菌种。为了进一步了解糖化酶分泌的机理，近年来运用分子生物学、生物化学和基因工程手段对糖化酶生物合成途径、编码基因及基因调控方面的研究成为热点。 D-异抗坏血酸作为一种食品添加剂，有着广阔的市场。荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)可应用于工业发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸，在此过程中，先利用糖化酶将淀粉糖化为葡萄糖，葡萄糖经荧光假单胞菌发酵生产出2-酮基-D-葡萄糖酸，2-酮基-D-葡萄糖酸经进一步加工生产出D-异抗坏血酸。目前我国生产的2-酮基-D-葡萄糖酸占世界总产量的50％以上(孙文敬等，2004)。 本研究目的是得到一种导入糖化酶基因的荧光假单胞菌工程菌，希望这种荧光假单胞菌分泌糖化酶，并直接以淀粉代替葡萄糖作为底物发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸。达到省略工业生产2-酮基-D-葡萄糖酸过程中糖化酶糖化工序，缩短发酵时间，节约成本，提高经济效益的目的。 本研究将黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2、pUCP19-K中得到重组质粒pBBR1MCS-2GA、pUCP19-KGA，分别转化2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4，得到重组荧光假单胞菌ARW4、ARH4。希望工程菌ARW4、ARH4可分泌糖化酶，经SDS-PAGE凝胶电泳分析，发现导入糖化酶基因的荧光假单胞菌ARW4的总蛋白与未导入基因的荧光假单胞菌AR4总蛋白相比，在分子量约为70.5kD处多了一条蛋白条带。此条带与糖化酶的蛋白分子量相一致，估计可能是所要表达的糖化酶蛋白带，为确定此蛋白带，用黑曲霉糖化酶免疫白兔，制备了黑曲霉糖化酶多克隆抗血清，Westernblot结果显示正常兔血清没有印迹上蛋白带，相比糖化酶多克隆抗血清在70.5kD处印迹出1条蛋白带，证明这条蛋白带就是表达出的糖化酶。但经SDS-PAGE凝胶电泳分析，表达出的糖化酶主要以不溶性包涵体形式存在，改变和优化诱导条件未能使目的蛋白得到可溶性表达，生物测定显示重组菌未能分泌有活性的糖化酶，这有待于进一步研究。 本研究首次将黑曲霉糖化酶基因cDNA在荧光假单胞菌中以包涵体形式表达出来，为今后进一步研究活性糖化酶蛋白的表达做出了初步探索，并对以荧光假单胞菌为宿主菌的基因工程菌表达系统的研究提供了理论基础。 此外在本研究过程中为了创造出能以卡那霉素为筛选标记的并在荧光假单胞菌中自我复制的广宿主表达载体，将Amp抗性标记的质粒pUCP19，利用PCR技术改造成Kan抗性标记的质粒pUCP19-K，为质粒改造的研究，进一步创造各种表达质粒做出了实践性探索。