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禽坦布苏病毒病(Avian Tembusu virus disease)是近年来在我国家禽中暴发流行的一种新传染病,其病原是禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATMUV)。该病主要引起成年蛋(种)禽采食和产蛋性能下降,以及雏禽的急性死亡和神经症状,对我国家禽养殖业造成较大危害。目前对ATMUV的致病机制研究较少,有关ATMUV调控宿主天然免疫应答机制研究鲜有报道。本课题以ATMUV CJD05株为病毒模型,以雏鸡、雏鸭、CEF、DEF、DF-1及293T细胞为体内、外研究模型,用RT-PCR及qRT-PCR测定病毒感染后Ⅰ型、Ⅲ型干扰素(IFNs)和一些主要抗病毒蛋白(ISGs)的mRNA表达水平。接着以293T细胞为模式细胞,通过RNA干扰技术(RNAi)及Western blotting技术,对 TLR3、MDA5、IPS-1、IRF3、IRF7 及 NF-ΚB 等信号分子在 ATMUV诱导IFNs转录激活中所扮演的功能进行分析,揭示ATMUV诱导宿主天然免疫应答的分子机制。最后,在DF-1细胞中干扰表达及过表达宿主IFITM家族蛋白,用TCIDs0及qRT-PCR测定IFITMs的差异表达对病毒复制的影响,鉴定出具有抗病毒效果的IFITMs基因,为ATMUV防控提供新思路。实验结果如下:一、ATMUV感染激活了宿主体内的天然免疫应答。ATMUV感染雏鸭能够引起发热和病毒血症,病毒主要分布在脾脏、肾脏、法氏囊等器官;攻毒后,脾脏上调表达大量Ⅰ型、Ⅲ型IFNs和ISGs,而肾脏和法氏囊仅轻微上调表达IFNs和ISGs,脾脏天然免疫应答强度高于肾脏和法氏囊。ATMUV感染雏鸡,脾脏也显著上调表达Ⅰ型、Ⅲ型 IFNs 和 ISGs。二、ATMUV感染激活了体外细胞天然免疫应答。ATMUV感染的宿主细胞(DEFs、CEFs)和模式细胞(DF-1、293T)均显著上调表达Ⅰ型、Ⅲ型IFNs和ISGs。三、ATMUV基因组RNA诱导宿主天然免疫应答。CEF细胞转染病毒基因组RNA和染毒细胞RNA后,IFNs和ISGs的表达量显著提高;而转染正常细胞的RNA不能激活IFNs和ISGs的表达。四、ATMUV感染激活宿主TLR3和MDA5介导的天然免疫信号。ATMUV感染CEFs后,模式识别受体TLR3和MDA5的mRNA表达水平显著提高,而其它TLRs没有明显上调表达。ATMUV感染293T细胞后同样激活了 TLR3和MDA5。ATMUV感染沉默MDA5、TLR3、IPS-1的293T细胞系,IFNs表达水平显著下降,证实ATMUV诱导IFNs的表达依赖模式识别受体TLR3、MDA5和信号衔接蛋白IPS-1。五、转录因子NF-κB、IRF3和IFR7参与了 ATMUV激活宿主IFNs的表达。ATMUV感染细胞中IκB蛋白表达水平逐渐下降,提示NF-ΚB的活性得到释放;用NF-κB抑制剂(BAY11-7082)预处理的293T细胞感染ATMUV后,IFNs的表达明显被抑制,证实NF-κB参与ATMUV激活IFNs的分泌。ATMUV感染沉默IRF3、IRF7的293T细胞系,IFNs的表达水平也明显下降。这些结果证实ATMUV感染过程中,转录因子NF-κB、IFR3、IRF7参与调控干扰素表达。六、禽IFITM1、IFITM3抑制ATMUV的感染与复制。IFITM是干扰素诱导的一类抗病毒ISGs。本研究应用shRNA技术,构建了稳定干扰鸡IFITM1、IFITM2、IFITM3的DF-1细胞系,ATMUV感染沉默鸡IFITM1、IFITM3的DF-1细胞系,ATMUV病毒载量显著增加,而沉默鸡IFITM2的DF-1细胞仅能轻微的促进病毒的增殖。接着,本研究进一步构建了鸡源、鸭源IFITM1和IFITM3的真核表达质粒。这些质粒转染DF-1细胞后发现,过表达禽源IFITM1、IFITM3能有效抑制病毒的增殖。过表达和沉默表达双重验证表明禽IFITM1、IFITM3是抑制ATMUV复制的关键抗病毒蛋白。此外,本研究还发现,用人源和鸡源干扰素预处理的细胞能显著抑制病毒复制,证实干扰素在抵抗ATMUV感染中扮演非常重要的角色。综上所述,本研究发现ATMUV感染可迅速诱导宿主启动天然免疫应答,宿主依赖TLR3和MDA5介导的天然免疫信号,激活转录因子NF-κB、IFR3、IFR7调控Ⅰ型、Ⅲ型的IFNs表达,后者诱导ISGs的表达,从而抑制ATMUV的感染与复制。IFNs及关键ISGs在抵抗ATMUV感染中扮演非常重要的角色。本研究结果为阐明禽坦布苏病毒的致病机制提供了重要科学依据,同时也为新型抗ATMUV药物的研发提供重要参考。