MicroRNA-1298-5p通过靶向SMC1A抑制宫颈癌细胞增殖和迁移的研究

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研究背景宫颈癌(cervical cancer,CC)是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居于女性第四位。每年约有530000名女性被诊断为宫颈癌,且逐渐呈现年轻化趋势。虽然近年来人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)DNA检测的发展和放化疗技术的规范运用在一定程度上降低了宫颈癌的发生率和死亡率,但是宫颈癌的复发率仍高达40%,在发展中国家的死亡率更是高达87%。因此了解宫颈癌的发病机制,寻找潜在的预后及靶向治疗指标,对于提高宫颈癌患者的生存率具有重大意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种非蛋白编码的小RNA分子,在转录后水平上调节靶基因的表达。miRNA可以结合到靶mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslated Regions,3’-UTR),通过剪切mRNA或抑制翻译来调节基因表达。以往的研究表明,miRNA的异常表达与包括宫颈癌在内的多种人类恶性肿瘤有关。MiR-1298是最近几年发现的一类新的miRNA分子,它被认为是一种肿瘤抑制剂,在膀胱癌、乳腺癌、肺癌和胃癌中均呈现下调表达,对肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡等都有一定的调控作用。我们课题组前期通过对宫颈癌组织和癌旁组织进行miRNA芯片测序,发现miR-1298-5p在宫颈癌组织中表达显著下调。然而,miR-1298-5p在宫颈癌中的功能及其作用机制目前尚不清楚。SMC1A作为SMC超家族的一员,是姐妹染色单体内聚所必需的内聚蛋白复合物的核心成分。其结构维护在染色体分离、细胞周期调控、基因修复及肿瘤发生等方面起着重要作用。SMC1A在多种恶性肿瘤中均出现上调表达或突变,并且SMC1A的过表达与结直肠癌患者的不良预后密切相关。在本研究中,我们检测了宫颈癌组织中miR-1298-5p和SMC1A基因的表达水平,并进一步探讨了miR-1298-5p上调表达对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。本研究主要分为两部分:第一部分,miR-1298-5p在宫颈癌组织和细胞中表达水平的检测;第二部分,miR-1298-5p对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响及其下游作用机制的初步研究。第一部分 miR-1298-5p在宫颈癌组织和细胞中的表达水平目的检测miR-1298-5p在宫颈癌组织及细胞中的表达水平,评估miR-1298-5p的表达水平与宫颈癌患者临床特征的相关性。方法1.收集32例宫颈癌患者的癌组织及其癌旁组织,通过qRT-PCR验证miR-1298-5p在宫颈癌癌组织及癌旁组织中的表达水平,并分析miR-1298-5p表达水平与宫颈癌患者临床特征的相关性。2.通过qRT-PCR检测miR-1298-5p在宫颈癌细胞系Siha、Hela及正常宫颈细胞系Ectl/E6E7的中的表达水平。结果1.与癌旁组织相比,miR-1298-5p在宫颈癌组织中表达水平较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且其表达水平与宫颈癌患者的FIGO分级和淋巴结转移有关(P<0.05)。2.与正常宫颈细胞系Ectl/E6E7相比,miR-1298-5p在宫颈癌细胞系Hela和Siha中下调表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。第二部分 miR-1298-5p通过靶向SMC1A影响宫颈癌细胞的增殖和迁移目的分析miR-1298-5p上调表达后对宫颈癌细胞增殖及迁移的影响,初步探究miR-1298-5p在宫颈癌中的潜在作用机制。方法1.将 miR-1298-5p mimic 和 mimic NC 转染入 Hela 和 Siha 细胞,利用qRT-PCR检测miR-1298-5p mimic的转染效率。通过CCK-8及Transwell实验分析miR-1298-5p上调表达对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。2.采用miRanda和Targetscan生物信息学软件预测miR-1298-5p的靶基因。构建SMC1A野生型和突变型质粒,分别将野生型质粒、突变型质粒和空白质粒与miR-1298-5p mimic或mimic NC共转染入细胞,分别检测各组报告基因荧光素酶的相对活性。3.利用qRT-PCR和Western blot检测miR-1298-5p上调表达对SMC1A表达水平的影响。4.采用qRT-PCR检测宫颈癌及癌旁组织中SMC1A的表达水平,并运用Person相关性分析探究其与miR-1298-5p表达的相关性。结果1.与 mimic NC 组相比,miR-1298-5p 在转染 miR-1298-5p mimic 的 Hela 和Siha细胞中显著上调(P<0.001)。转染miR-1298-5p mimic组的Hela和Siha细胞的增殖和迁移能力明显低于mimic NC组(P<0.05)。2.双荧光素酶报告基因实验结果显示上调miR-1298-5p表达使得含有SMC1A野生型报告基因的荧光素酶活性下降至42.6%,而对突变型和空白质粒则无明显影响,统计分析有显著性差异(P<0.01)。3.与 mimic NC 组相比,转染 miR-1298-5p mimic 后,Hela 和 Siha 细胞中SMC1A mRNA和蛋白的表达水平均明显下降(P<0.05)。4.与癌旁对照相比,SMC1A在宫颈癌组织中上调表达,且与miR-1298-5p的表达水平具有负相关性(P<0.05)。结论MiR-1298-5p在宫颈癌中发挥抑癌作用,可能通过靶向SMC1A抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移。
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