哺乳动物基因组中,只有很少的基因属于印记基因(大约<5%),但在胎儿的整个生长及行为的发育过程中,这些少量的印记基因却起着相当重要的作用。在哺乳动物早期胚胎发育过程中,印记基因有两次重编程过程,一个是受精卵发育成早期胚胎的过程,另一个是原始生殖细胞发育成成熟配子的过程。在这两次过程中,如果重编程异常,则会引起多种疾病,这些疾病与基因组印记紊乱引起的异常表达有关。因此,研究早期胚胎印记基因的表达调控非常重要。早期胚胎印记基因研究中,只能用RNA-FISH技术在细胞水平上进行研究,但其难度大,一次只能检测一个基因。随着生物技术的发展,2007年首次在分子水平上实现了单细胞检测技术。到目前为止已经探索了四种不同的单细胞检测技术,分别为:scRNA-Seq 3’转录组分析技术、RNA-Seq的单细胞标记逆转录技术(Single-cell Tagged Reverse Transcription,STRT)、CEL-Seq技术和Smart-Seq技术。第一种技术准确度高,但只能检测m RNA的3’端。后三种技术则是对完整m RNA进行分析,其中STRT技术在逆转录过程中易出现断片;CEL-Seq技术具有偏好性,扩增量大且成本较高;Smart-Seq技术不稳定,且低水平表达的转录组可能会丢失。在本实验的研究中,只需检测早期胚胎的3’-UTR区。根据这四种技术的优缺点,最终选择scRNA-Seq 3’转录组分析技术对早期胚胎印记基因进行分析。通过在单细胞水平上对印记基因的表达进行检测,可以提供更多的数据研究哺乳动物早期胚胎发育,也为早期胚胎发育重编程问题的解决提供理论依据。本实验首先利用生物信息学在印记基因专业网站(Geneimprint网站)上查找出父源和母源的印记基因,并对这些基因的表达来源、SNP位点、小鼠品系之间的差异、染色体位置和属性进行归纳总结。然后利用Beacon Designer软件对NCBI数据库中印记基因的m RNA序列进行引物设计。在此基础上,采集十个时期(受精卵、早期2细胞期、中期2细胞期、晚期2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、早期囊胚、中期囊胚和晚期囊胚)的胚胎,利用scRNA-Seq 3’转录组分析技术对单细胞进行提取及扩增,最后再用磁珠纯化扩增产物。纯化后的cDNA分别用两个持家基因(Ddx3x、Pdha1)检测其表达,选出有表达的样本做RT-qPCR,并进行分析。实验结果表明,利用单细胞提取RNA对印记基因的表达进行研究是可行的;印记基因的表达具有时空特异性,不同发育时期的胚胎样品浓度存在差异,基因表达也存在差异,这个结果在文献中得到了验证;持家基因mGapdh的表达存在不稳定性,不能作为印记基因表达的内参基因;为以后早期胚胎发育重编程的研究奠定了基础。