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纳米酶是新一代具有模拟酶性质的纳米材料。近年来,由于其可控的催化活性、简便的合成方法以及良好的稳定性等优点而得到广泛地研究与应用。可变价离子介导的类芬顿反应是纳米酶活性的关键,铜、铁、钴、铈、锰等金属基纳米材料被发现具有过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化酶(OXD)等模拟酶活性。铜基过氧化物酶在细胞或者细菌中催化双氧水(H2O2)分解所产生的致命的活性氧(ROS)风暴,奠定了其应用于生物医学领域的基础。然而,纳米酶普遍都存在体内难以降解的问题,这是限制其生物医学应用的主要瓶颈。而磷酸盐玻璃(PBG)优异的生物相容性和可降解性为解决这一难题提供了可行方案,在骨修复、组织工程等研究领域已得到广泛应用。基于铜离子的可变价性介导的纳米酶性质以及PBG的可控降解性等思路,本文设计了一种可降解铜掺杂磷酸盐玻璃(Cu-PBG)纳米酶,并采用经典的水热法成功合成了不同铜掺杂量的PBG纳米材料,对其模拟酶活性和可降解性开展了相应研究,在此基础上进一步探索了Cu-PBG纳米酶的抗菌活性及抗菌机制。本文主要包含以下几个方面的研究内容:1.不同铜掺杂量的PBG纳米球的制备及其模拟酶活性、可降解性能研究。(1)不同铜掺杂量的PBG纳米球的制备。首先以磷酸、五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硫酸铁(Fe2(SO4)3)、七水合硫酸钴(Co SO4·7H2O)为原料,尿素为沉淀剂,十二烷基硫酸钠(SDS)为形貌控制剂,通过经典的水热合成法成功合成了Cu-PBG纳米球、铜、铁共掺杂磷酸盐玻璃(Cu,Fe-PBG)纳米球,以及不掺铜的钴掺杂磷酸盐玻璃(Co-PBG)纳米球。然后通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、粉末X射线衍射仪、扫描透射电子显微镜、X射线光电子能谱仪、傅里叶变换红外光谱仪等对Cu-PBG纳米球的形貌、粒径分布、成分以及结构进行了表征。其中Cu-PBG纳米球直径在210~220 nm左右,Cu,Fe-PBG纳米球直径在350~400 nm左右,Co-PBG纳米球直径在250~300 nm左右,且结果表明三者的掺铜量分别为31.65%,24.53%,0%。(2)Cu-PBG纳米酶的模拟酶活性研究。首先通过3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色实验研究铜掺杂量、p H值、反应时间对Cu-PBG纳米球POD活性的影响。实验结果表明Cu-PBG纳米球的POD活性具有明显的p H依赖、反应时间依赖特点,酸性环境下的POD活性更为显著。而相同条件下检测的铜掺杂量低的Cu,Fe-PBG纳米球以及不掺铜的Co-PBG纳米球的POD活性呈现明显的降低,可以忽略不计。其次采用H2O2产氧量测试法确定了Cu-PBG纳米球的CAT活性。结果表明,在中性环境中Cu-PBG纳米球表现出更优异的CAT活性。因此可以确定,Cu-PBG纳米酶的模拟酶活性依赖于环境的p H值,在较低p H值的条件下其表现出显著的POD活性,催化H2O2分解产生ROS,使得TMB-H2O2反应体系迅速变蓝;而在中性p H值的条件下其表现出显著的CAT活性,催化H2O2分解产生氧气,使得反应体系产氧量明显增高。(3)Cu-PBG纳米酶催化H2O2分解产ROS的检测。使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为ROS指示剂、对苯二甲酸(TA)为羟基自由基(·OH)捕获剂、电子自旋共振技术以及谷胱甘肽(GSH)的消耗检测对Cu-PBG纳米酶催化产ROS进行检测。结果表明,在H2O2存在的情况下,成功检测到了催化H2O2分解产生的强氧化性·OH,这进一步导致还原性的GSH的消耗。(4)Cu-PBG纳米酶可降解性研究。通过检测不同p H条件下铜离子释放量、质量损失、降解沉淀形貌及粒径变化对Cu-PBG纳米酶的可降解性能进行表征。实验结果表明Cu-PBG纳米酶在72 h内降解率接近100%,在中性以及微酸性条件下的铜离子释放率分别为44.8%、46.8%,且降解12 h后Cu-PBG纳米球形貌就发生改变,粒径减小至原来的43.5%。2.可降解Cu-PBG纳米酶体外抗菌应用与研究。(1)Cu-PBG纳米酶抗菌效果研究。通过细菌及其生物膜的平板克隆实验、死/活染色实验以及细菌的形态观察对Cu-PBG纳米酶体外抗菌效果进行研究。结果表明,Cu-PBG纳米酶对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)都具有杀伤效果,而在H2O2存在的条件下,Cu-PBG纳米酶抗菌活性显著提高,展现出针对革兰氏阳性和阴性菌的广谱抗菌性能。此外,铜的掺杂量对抗菌活性影响显著,铜掺杂量低的Cu,Fe-PBG纳米球以及不掺铜的Co-PBG纳米球的抗菌活性明显减弱。(2)Cu-PBG纳米酶抗菌机制研究。通过细菌细胞内ROS水平检测以及DNA降解检测可以得出结论,Cu-PBG本身的抗菌活性来源于材料降解释放的铜离子对细菌基因组DNA的损伤;而在H2O2辅助下,除了释放铜离子,Cu-PBG纳米酶还表现POD活性,释放强氧化性的·OH风暴,对细菌进行致命杀伤。3.可降解Cu-PBG纳米酶的体内动物水平的抗菌的应用与研究。首先通过溶血实验以及血液学毒性分析对Cu-PBG纳米酶的生物相容性进行了评价,实验结果表明,Cu-PBG纳米酶没有对红细胞造成明显破坏,也没有表现出急性以及慢性毒性。其次在动物细菌感染伤口治疗实验中,通过对伤口愈合情况、伤口细菌存活情况、伤口组织病理改变进行分析来对Cu-PBG纳米酶的杀菌活性和促伤口愈合能力进行表征。炎症伤口组织的微酸性环境以及高于正常组织的内源性H2O2水平,使得在外源性H2O2的加持下,Cu-PBG纳米酶释放铜离子损伤细菌DNA,同时表达POD活性将H2O2转化为强氧化性的·OH,从而对细菌造成致命杀伤,促进炎症消失及伤口愈合。