背景和目的牙周病治疗的最终目标是能够消除牙周组织局部的炎症,再生和重建具有结构学和功能学意义的牙周膜、牙骨质和骨组织。然而由于牙周疾病病因学和口腔微环境极其复杂和特殊,目前还没有疗效满意的治疗方法。近些年来,基于干细胞技术的组织工程方法为牙周组织再生和重建提供了新的思路和方法。种子细胞、支架材料、生长因子是传统的组织工程学研究领域主要的研究内容,其中,寻找来源丰富、取材方便、具有增殖分化潜能的种子细胞是目前组织再生医学研究中的热点。目前用于牙周再生研究中的干细胞主要牙源性和非牙源性两大类。牙源性干细胞的来源包括牙周膜,人类脱落的乳牙,根尖部的牙乳头,牙囊组织及牙髓组织。非牙源性干细胞主要有骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)和脂肪干细胞。其中,来源于牙周膜的干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是牙周再生研究中应用最多的细胞之一。甚至有学者认为PDLSCs优于BMSCs(16)和其他牙源性间充质干细胞,将PDLCs应用于牙周组织再生可能会更具有临床实际意义。在牙周组织的再生中,牙槽骨的再生至关重要。牙槽骨在牙周组织中是一个代谢活跃的器官,在整个生命周期中都在进行不断的更新和改建。其形态发生和重建由两个对立统一的过程所控制：成骨细胞(osteoblast, OB)介导的骨基质合成和破骨细胞(osteoclast, OC)介导的骨吸收过程。一般认为,作为种子细胞的牙周膜干细胞修复骨组织缺损的作用主要是利用牙周膜干细胞向成骨细胞定向分化能力。但其通过细胞-细胞接触或通过旁分泌细胞因子对机体自身其他细胞的影响亦被认为是促进牙周再生的重要机制。牙周膜干细胞对成骨细胞和破骨细胞分化的影响及其机制有待进一步阐明。本研究过体外分离纯化培养PDLSCs,并将PDLCs分别与成骨前体细胞和破骨细胞前体细胞共培养,探讨PDLCs对成骨前体细胞成骨分化及破骨前体细胞破骨分化的影响作用,进一步丰富PDLCs在牙周组织工程中的作用机制,并为完善牙周组织工程技术临床应用提供理论依据。方法1.牙周膜干细胞的分离培养和鉴定1.1 PDLSCs的分离培养利用酶消化和组织块混合培养法从临床阻生拔除的第三磨牙和因正畸需要拔除的健康前磨牙(牙根已发育完成)的牙周膜中获得原代细胞,消化传代后,取P3-P5的细胞供后续实验使用。利用有限稀释法,挑取单克隆获得具有干细胞特性的细胞PDLSCs进行传代培养。1.2干细胞特性及多向分化能力鉴定分别对分离纯化的PDLSCs进行克隆形成率(CFU-F)分析,流式细胞术检测细胞表面分子表达。在体外以0.1 u M地塞米松,10 mM β-甘油磷酸钠,50 mg/ml维生素C-二磷酸盐诱导PDLSCs向成骨细胞分化,茜素红染色法检测钙化结节的形成；以0.1 pM地塞米松,60 μM吲哚美辛,50 mg/ml维生素C-二磷酸盐分别诱导PDLSCs向脂肪细胞分化并用油红0 (Oil Red 0)染色检测脂肪滴的形成。2.牙周膜干细胞对成骨前体细胞成骨分化作用研究本实验利用分离纯化的PDLSCs,将牙周膜干细胞与成骨细胞前体细胞共培养,检测成骨细胞分化转录因子ALP,BSP, OPN的mRNA表达及BSP,OPN蛋白的表达水平,并观察成骨细胞矿化结节形成情况。分析牙周膜干细胞对成骨细胞分化的影响。3.牙周膜干细胞对破骨前体细胞破骨分化作用研究由于破骨细胞是分化终末细胞,所以将PDLSCs与破骨细胞前体细胞共培养,对破骨细胞进行形态学观察并计数,检测Cathepsin K (CSTK), TRAF6, TRAP等破骨细胞标志mRNA及TRAF6, TRAP蛋白的表达水平,观察PDLSCs对破骨细胞分化的影响。结果1.牙周膜干细胞的分离培养和鉴定PDLSCs原代培养3天后,倒置显微镜观察可见分散的细胞贴壁伸展,当细胞密度达到瓶底的70%-80%时,进行传代培养。PDLSCs在体外呈集落样增殖,克隆形成率分析(CFU-F)结果显示,PDLSCs的克隆形成能力高。用有限稀释法获得成纤维细胞集落克隆形成单位,将单个克隆扩大培养,获得具有自我更新能力的人PDLSCs。经流式细胞仪检测细胞表面标记显示,该细胞表达CD29、CD105、 CD90、STRO-1,而不表达CD34、CD45。PDLSCs经成骨诱导培养基诱导4周后,经茜素红染色后均能观察到大小不一的红染的矿化结节,PDLSCs向脂肪细胞方向诱导2周后,经油红0染色,可见有红色脂肪小滴形成。2.牙周膜干细胞对成骨前体细胞成骨分化的作用2.1 PDLSCs增加了MC3T3-E1 ALP活性ALP活性是成骨细胞早期分化的一个特征性标志。本实验中对与PDLSCs的MC3T3-E1共培养实验组和仅有MC3T3-E1培养的对照组,在第7天和第14天时分别测定MC3T3-E1的ALP活性,结果显示有PDLSCs存在的共培养体系中MC3T3-E1的ALP活性显著增加。2.2 PDLSCs增加了MC3T3-E1成骨标志物mRNA的表达为了进一步确定PDLSCs对MC3T3-E1成骨分化的作用,RT-PCR检测共培养不同时间段后,PDLSCs与MC3T3-E1共培养实验组和仅有MC3T3-E1的培养对照组中基因的表达水平。结果显示,与对照组相比,在与PDLSCs共培养了7天后,MC3T3-E1的ALP和BSP基因表达水平显著上调,但是OPN的基因表达水平没有显著性差异。在第14和21天时,ALP、BSP、OPN的基因表达水平均显著升高,并且在共培养体系中,ALP基因表达水平在第14天时最高,BSP和OPN的基因表达水平在第21天时最高。2.3 PDLSCs促进MC3T3-E1的BSP和OPN的蛋白表达Western blotting检测共培养不同时间段后,PDLSCs与MC3T3-E1共培养实验组和仅有MC3T3-E1的培养对照组中成骨标志性蛋白的表达。结果显示,共培养组与对照组相比,BSP蛋白表达在第7、14、21天时均显著增加,晚期成骨标志性蛋白OPN在第14和21天时亦显著增加。2.4 PDLSCs增加了MC3T3-E1矿物沉积在第21天时,与对照组相比,PDLSCs显著增强了MC3T3-E1的矿物化；通过菌素红染色可以看到共培养体系中矿化结节有所增大。3.牙周膜干细胞对破骨前体细胞破骨分化作用研究3.1 PDLSCs促进了RAW264.7破骨细胞样细胞的形成应用TRAP染色来检测与PDLSCs共培养的RAW264.7破骨细胞分化,结果显示,与对照组相比,PDLSCs显著增加了RANKL刺激下RAW264.7 TRAP+的破骨细胞样细胞的形成。3.2 PDLSCs增强了RAW264.7破骨分化标志基因的表达通过检测与PDLSCs共培养的RAW264.7实验组和仅有RAW264.7培养的对照组破骨标志基因的表达,进一步验证PDLSCs对破骨分化过程的影响。结果显示,在与PDLSCs共培养的RAW264.7实验组中,TRAP, TRAF6和CTSK的表达水平显著上调。3.3 PDLSCs增加了RAW264.7 TRAP和TRAF6的蛋白表达水平Western blotting检测与PDLSCs共培养的RAW264.7实验组和仅有RAW264.7培养的对照组破骨标志蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,在第3天和第7天时,共培养体系中RAW264.7的TRAP和TRAF6的蛋白表达显著增加。结论本实验通过间接共培养体系研究显示,PDLSCs能够增强成骨前体细胞MC3T3-E1 ALP活性,增加ALP、BSP、OPN mRNA和BSP、OPN蛋白的表达以及矿化基质的沉积。同时能促进了破骨细胞的成熟,提高了破骨前体细胞RAW264.7 TRAP、CSTK、TRAF6 mRNA和TRAP、TRAF6蛋白的表达。这些结果表明,PDLSCs可能以旁分泌的形式在一定程度上调节成骨分化和破骨分化。同时反映了PDLSCs促进牙周再生机制的复杂性,其对破骨细胞分化促进作用的意义有待进一步探讨。